二氢叶酸还原酶

二氢叶酸还原酶( EC 1.5.1.3 ) 将二氢叶酸转化为四氢叶酸,这是嘌呤、胸苷酸和某些氨基酸从头合成所需的甲基穿梭。DHFR 被甲氨蝶呤(MTX) 抑制,MTX 是一种用作抗肿瘤和免疫抑制剂的叶酸类似物。除了功能性DHFR基因外,至少还有4个无内含子基因可能是假基因。5个中的每一个都位于单独的染色体上。当这种情况发生在功能基因座上时,假基因不会进行扩增(Anagnou 等,1984)。

▼ 克隆与表达

Chen 等人克隆并表征了功能性 DHFR 基因(1982)和陈等人(1984)。

班卡等人(2011)发现 DHFR 在胎儿和成人大脑和全血中广泛表达;成人脑中的表达高于胎儿脑。

▼ 基因结构

陈等人(1984)确定 DHFR 基因长约 30 kb,由 6 个外显子组成,由 5 个内含子隔开。

通过比较来自细菌和哺乳动物生物体的同源酶的真核基因序列和蛋白质序列,Craik 等人(1983)指出内含子-外显子连接经常与蛋白质结构的可变表面环重合。研究的蛋白质包括 DHFR、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶。他们指出,改变的表面结构可以解释家族成员之间的功能差异,例如丝氨酸蛋白酶。内含子-外显子连接的“滑动”可能构成产生长度多态性和发散序列的机制。因此可以在不破坏蛋白质核心稳定性的情况下实现不同的功能。

▼ 测绘

从使用人类 DHFR cDNA 探针对来自人类-小鼠和人类-中国仓鼠细胞杂交体分离人类染色体的基因组 DNA 进行 DNA 转移杂交分析,Maurer 等人(1984)得出结论,5 号染色体携带 DHFR 基因座。通过观察到人类 DHFR 基因的伴随丧失和对白喉毒素(126150)(一种染色体 5 标记)的敏感性,在 2 种人-鼠细胞杂种中被证实对毒素具有抗性。通过人胎儿成纤维细胞和 DHFR 缺陷的中国仓鼠卵巢细胞系的体细胞杂交,Funanage 等人(1984)将 DHFR 基因分配到 5 号染色体,并且在携带 5 号染色体畸变的细胞系的情况下,进一步将分配范围缩小到 5q11-q22。对染色体 5 的分配也得到了同线性同源性的支持(Myoda 和 Funanage,1983)。

毛雷尔等人(1985)将 DHFR 分配给 5q23,这与其他分配不一致(Anagnou 等人,1984 年;Funanage 等人,1984 年)(根据新数据,HGM10 得出结论,DHFR 位于 5q11.2-q13.3 区域。)Killary 等(1986)发现 Dhfr 对应到小鼠 13 号染色体,就像人类 5 号染色体上的另一个基因,即氨基己糖苷酶 B(Hex2)。

DHFR假基因

阿纳努等人(1984)将假基因 4(DHFRP4 )分配给染色体3。Anagnou 等人(1985)通过人-啮齿动物体细胞杂交将 DHFR 假基因 1 定位到 18 号染色体,将假基因 2(DHFRP2) 定位到 6 号染色体。Pseudogene-1(DHFRP1) 显示出与最近起源一致的缺失/存在多态性(这也由功能基因的编码序列的序列同一性表明)。“完美”假基因的转座一定发生在种族群体发展之前:地中海人的假基因频率最高(94%),美国黑人的假基因频率最低(32%)(Anagnou et al., 1988)。阿纳努等人(1987)报道说 DHFR 假基因 1 识别了 3 个 RFLP。

麦肯蒂等人(2011)发现 DHFRP4,他们将其重命名为 DHFRL1( 616588 ),在人类中表达并编码一种功能性酶。

▼ 基因功能

四氢生物蝶呤(BH4) 是内皮型一氧化氮合酶(eNOS)(NOS3; 163729 )的辅助因子,通过 DHFR 从其氧化形式二氢生物蝶呤(BH2) 再生。Chalupsky 和 ​​Cai(2005)发现通过 RNA 干扰抑制牛主动脉内皮细胞中的 Dhfr 显着降低内皮 BH4 和一氧化氮的生物利用度。血管紧张素 II( 106150 ) 还通过过氧化物依赖性 Dhfr 下调引起 BH4 缺乏,这种反应与 eNOS 产生的超氧化物显着增加有关。在血管紧张素 II 刺激的细胞中,人类 DHFR 的过度表达恢复了一氧化氮的产生并减少了超氧化物的 eNOS 产生。查卢普斯基和蔡(2005)得出的结论是,DHFR 对内皮中的 BH4 和一氧化氮生物利用度至关重要。

马蒂亚诺夫等人(2007)证明,在静止细胞中,DHFR 基因主要启动子的转录抑制机制取决于从上游次要启动子启动的非编码转录物,并涉及 RNA 的直接相互作用和启动子特异性干扰。抑制的特异性和效率通过在非编码 RNA 和主要启动子之间形成稳定的复合物、非编码 RNA 与一般转录因子 IIB 的直接相互作用以及预启动复合物与主要启动子的解离来确保。Martianov 等人通过使用体内和体外检测,如诱导和重组转录、RNA 带移、RNA 干扰、染色质免疫沉淀和 RNA 免疫沉淀(2007) 表明由次要启动子产生的调节转录物在启动子特异性转录抑制的表观遗传机制中具有关键功能。

McEntee 等人使用纯化的重组酶(2011)发现在 NADPH 存在下,DHFR 和 DHFRL1 都将二氢叶酸还原为四氢叶酸。DHFRL1 的比活性远低于 DHFR,但对 NADPH 的亲和力没有显着差异。EMSA 实验表明 DHFRL1 与 DHFR 一样,结合了自己的 mRNA。此外,DHFRL1 和 DHFR 都与另一种酶的 mRNA 结合,这表明不仅是负反馈环,而且可能是一种复杂的交叉调节模式。DHFR 和 DHFRL1 都补充了大肠杆菌和哺乳动物细胞中二氢叶酸还原酶的缺失。

▼ 分子遗传学

在甲氨蝶呤(一种化学治疗剂)存在的情况下培养的哺乳动物细胞会对该药物产生耐药性。有时这是由于 DHFR 基因(甲氨蝶呤的主要靶标)发生突变。Blakley 和 Sorrentino(1998)指出,然而,不可能将这种多态性与肿瘤疾病的耐药性与甲氨蝶呤治疗联系起来。

DNA 序列扩增是人类肿瘤中基因组不稳定性最常见的表现之一。在大多数人类肿瘤细胞中,扩增的 DNA 序列是在不稳定的染色体外双分钟(DM) 上产生的。辛格等人(2000)分离了大量孤立的耐甲氨蝶呤的人类细胞系,所有这些细胞系都含有携带 DHFR 的 DM。除了其中之一之外,所有其他人都部分或完全丧失了其中一条携带 DHFR 的亲本染色体。少数群体中的细胞在扩增过程中表现出可能是瞬时中间体,包括初始均匀染色染色体区域(HSR)、随后的断裂、含有 DHFR 的片段的出现,以及最后的 DM。研究表明,HSR 和 DM 都是由染色体断裂引发的,但细胞类型在最终处理和/或维持额外序列的方式上有所不同。

约翰逊等人(2004)对多病例脊柱裂(SB) 家族的 157 名成员和 219 名无关对照进行基因分型,以发现 DHFR 基因内含子 1 中的 19 bp 缺失。他们发现,与对照组相比,缺失等位基因的纯合性在 SB 母亲(p = 0.049)中显着更频繁,但在 SB 父亲或患者中则不然,并且与显着增加的优势比(OR,2.035)相关联SB 母与其他基因型相比。约翰逊等人(2004)建议减少叶酸可能更适合在怀孕期间补充以预防脊柱裂。

Parle-McDermott 等人对 283 名爱尔兰神经管缺陷(NTD) 病例及其父母和 256 名对照组进行了研究(2007)发现 DHFR 基因内含子 1 中的 19 bp 缺失,与Johnson 等人先前报道的与脊柱裂的关联相反(2004),当以 1 或 2 份存在时,似乎可以防止受 NTD 影响的怀孕风险(两者的 p = 0.01)。

米什拉等人(2007)在 DHFR cDNA 的 3-prime 非翻译区中鉴定了一个 829C-T SNP,该区域位于推定的 miR24(见 MIRN24-1;609705)结合位点下游 14 个核苷酸处。更常见的 829C 等位基因在人类和啮齿动物中是保守的。过表达和抑制剂研究表明,当 DHFR 转录本包含 829C 等位基因但不包含 829T 等位基因时,miR24 会下调 DHFR 蛋白表达。当在培养细胞中表达时,829T 等位基因导致 DHFR 转录本半衰期延长 2 倍,并且由于 DHFR 蛋白水平升高,与表达 829C 等位基因的细胞相比,对甲氨蝶呤的耐药性增加了 4 倍。米什拉等人(2007) 得出的结论是,829T 等位基因干扰了 miR24 对 DHFR 的下调,导致酶过量产生和耐药性。

二氢叶酸还原酶缺乏引起的巨幼红细胞性贫血

在 6 名患有巨幼红细胞性贫血和 DHFR 缺乏症的患者中( 613839 ),Banka 等人(2011)和Cario 等人(2011)同时且孤立地鉴定了 DHFR 基因中的纯合突变(分别为 L80F;126060.0001和 D153V;126060.0002)。表型不同:Banka 等人报告的 3 名患者(2011)严重延迟了精神运动发育、全身性癫痫发作以及大脑和小脑萎缩,而Cario 等人报告的 3 名同胞(2011)无症状或患有儿童失神癫痫伴眼睑肌阵挛和轻度学习障碍。亚叶酸治疗改善了血液学和癫痫表型。该表型是由甲基四氢叶酸的大脑水平降低引起的。

▼ 动物模型

在一项由国际小鼠表型分析协会(IMPC) 创建的 1,751 个敲除等位基因的研究中,Dickinson 等人(2016)发现人类 DHFR 的小鼠同源物的敲除是纯合致死的(定义为在断奶前筛选至少 28 只幼崽后没有纯合小鼠)。

▼ 等位基因变体( 2 精选示例):

.0001 由于二氢叶酸还原酶缺乏引起的巨幼红细胞性贫血
DHFR、LEU80PHE
在 2 名受影响的同胞中,其父母是直系表兄弟英国巴基斯坦人,由于二氢叶酸还原酶缺乏导致巨幼红细胞性贫血( 613839 ),Banka 等人(2011)鉴定了 DHFR 基因外显子 3 中的纯合 238C-T 转换,导致 leu80 到 phe(L80F) 取代高度保守的残基。来自另一个巴基斯坦近亲家庭的患有这种疾病的孩子也被发现是 L80F 突变的纯合子。在 292 条种族匹配的巴基斯坦对照染色体中未发现该突变。对患者来源的淋巴母细胞的研究表明,DHFR 蛋白水平无法检测,酶活性严重降低。杂合亲本中的类似研究显示,与野生型相比,蛋白质和活性处于中等水平。患者红细胞中也有叶酸和二氢叶酸的积累,表明酶活性丧失。L80F 突变的分子模型预测了显着的空间冲突和辅因子结合的破坏。动态模拟表明 L80F 突变可能导致 DHFR 蛋白的潜在不稳定或 NADPH 结合的破坏。这些患者具有严重的表型,在婴儿期发病,发育迟缓,难治性癫痫发作,以及脑和小脑萎缩。

.0002 由于二氢叶酸还原酶缺乏引起的巨幼红细胞性贫血
DHFR, ASP153VAL
Cario 等人在 3 名患有欧洲血统远亲的同胞中,由于二氢叶酸还原酶缺乏而患有巨幼红细胞性贫血( 613839 )(2011)鉴定了 DHFR 基因外显子 5 中的纯合 458A-T 颠换,导致 asp153-to-val(D153V) 取代。父母双方都是 D153V 突变的杂合子,这在 120 个对照样本中未发现。预计该突变会中断氢键,影响折叠和构象稳定性,导致酶活性降低。对患者类淋巴母细胞的研究表明,DHFR 活性降低至对照水平的约 10%。DHFR 表达与对照相似,但蛋白质水平严重降低。尽管 1 名同胞除巨细胞增多症外基本未受影响,但其他 2 名同胞在儿童期发展为儿童失神癫痫伴眼睑肌阵挛。一个有学习障碍。脑脊液中 5-甲基四氢叶酸(5-MTHF) 的水平较低,但经亚叶酸处理后有所改善。