淋巴增强剂结合因子 1

LEF1 是一种核蛋白,在前 B 细胞和 T 细胞中表达。它与 T 细胞受体-α(TCRA;参见186880 ) 增强剂中的一个重要功能位点结合并赋予最大增强剂活性。LEF1 属于与高迁移率组蛋白-1(HMG1; 163905 )具有同源性的调节蛋白家族( Waterman et al., 1991 ; van Genderen et al., 1994 )。

▼ 克隆与表达

通过对从 Jurkat 人 T 细胞核提取物中纯化的 TCF1-α 胰蛋白酶肽进行测序,然后进行 PCR 并筛选 Jurkat cDNA 文库,Waterman 等人(1991)克隆了 2 个 TCF1-α 剪接变体。推导出的全长蛋白质包含 399 个氨基酸,计算分子量为 44.2 kD。TCF1-α 的 C 端半部分包含一个富含丝氨酸和苏氨酸的片段、一个与 HMG 和非组蛋白染色体蛋白的保守区域具有相似性的 68 个氨基酸结构域以及推定的核定位信号。较短的 TCF1-α 变体编码的蛋白质在富含丝氨酸和苏氨酸的区段内具有框内 28 个氨基酸缺失。Northern 印迹分析在小鼠和人类 T 细胞系和小鼠胸腺中检测到丰富的 3.4-kb 转录物和少量 2.3-kb 转录物,但在 B 细胞系、巨噬细胞系或检查的其他小鼠组织中未检测到。纯化的人 TCF1-α 的 SDS-PAGE 显示 3 个不同的蛋白质条带,

通过筛选人类基因组 PAC 文库和睾丸、黑色素瘤和胎儿脑 cDNA 文库,Hovanes 等人(2000)确定了几个 LEF1 剪接变体。最常见的转录物编码 399 个氨基酸的蛋白质,它包含一个保守的 N 端 β-连环蛋白(CTNNB1; 116806 ) 结合域和一个 C 端 HMG 型 DNA 结合/弯曲域。另一种变体编码一个 413 个氨基酸的蛋白质,在 C 末端有所不同。在作者称为外显子 3a 和 3b 的内含子 3 中使用可变剪接序列引入了框内终止密码子,产生了 16 和 18 kD 的蛋白质,这些蛋白质缺乏 HMG 样 DNA 结合结构域和核定位信号。预计这些蛋白质是细胞质的并且能够与β-连环蛋白相互作用。

▼ 基因功能

Waterman 等人使用足迹、流动性转移和西南印迹实验(1991)表明重组全长 TCF1-α 及其分离的 HMG 样结构域与 TCRA 增强子中的 DNA 序列 5-prime-GGCACCCTTTGAA-3-prime 结合,最有可能作为单体。在 HeLa 细胞中表达后,TCF1-α 激活了包含 TCF1-α 结合基序的报告基因的表达。

周等人(1995)报道了几个头发角蛋白基因(见 KRTHA1; 601077 ) 具有一致的 LEF1 结合基序,位于与其 TATA 框相似的位置。他们证明了 LEF1 在体外与毛发角蛋白启动子结合,并且 LEF1 存在于外胚层的皮肤发育过程中,当细胞分化时会表达这些启动子。此外,他们发现小鼠 Lef1 mRNA 存在于多能外胚层中,并且在下层间充质凝聚物形成和上层外胚层细胞内陷并成为毛囊之前,它以高度受限的模式被上调。

霍瓦内斯等人(2000)用含有 LEF1 启动子区域的报告基因构建体转染人和其他哺乳动物细胞系,并观察到成熟人 T 细胞和 B 细胞系中的最高 LEF1 表达。由于 LEF1 基因不在 B 淋巴细胞中表达,Hovanes 等人(2000)提出 LEF1 的表达通常在 B 细胞中被测试的启动子片段中不存在的元素沉默。

Wnt(见164975)信号通路的组成性激活是许多结肠癌的根本原因。该通路的激活是由稳定 β-连环蛋白(CTNNB1; 116806 )的基因突变引起的,使其在细胞核中积聚并与淋巴增强因子和 T 细胞因子家族转录因子的其他成员形成复合物。统称为 LEF/TCF;参见 TCF4, 602272 ) 以激活靶基因的转录。霍瓦内斯等人(2001)报道 LEF1 是结肠癌中异位激活的靶基因。这种异位表达的模式是不寻常的,因为它源于选择性激活启动子的全长 LEF1 异构体,该异构体结合 β-连环蛋白,而不是驱动显性负异构体表达的第二个内含子启动子。β-连环蛋白/TCF 复合物可以激活全长 LEF1 的启动子,表明在癌症中,这些复合物的高水平会通过诱导全长、β-连环蛋白敏感的选择性表达来错误调节转录,从而有利于 Wnt 信号传导的正反馈回路LEF/TCF 的形式。de Lau 和 Clevers(2001)讨论了研究结果的重要性。

美林等人(2001)表明 Lef1 和 Tcf3( 604652 ) 控制小鼠皮肤中多能干细胞的分化。Lef1 需要 Wnt 信号和稳定的 β-连环蛋白来表达头发特异性角蛋白并控制头发分化。相比之下,Tcf3 孤立于其 β-连环蛋白相互作用域来抑制表皮分化的特征,其中 Tcf3 通常被关闭,并促进毛囊外根鞘和多能干细胞的特征。Lef1 缺乏其 β-连环蛋白结合域抑制头发分化并支持皮脂腺细胞分化。

安本等人(2002)发现 LEF1 和 MITF( 156845 ) 同种型 MITF-M 在几种哺乳动物细胞系中的功能合作导致 DCT( 191275 ) 启动子(一种早期黑素细胞标记物)的协同反式激活。β-连环蛋白是有效反式激活所必需的,但对于 MITF-M 和 LEF1 之间的相互作用是可有可无的。

肺、牙齿和毛囊等多种器官的形态发生是由一层上皮干细胞的向下生长引发的。在滤泡形态发生过程中,干细胞通过改变它们的极性和细胞-细胞接触来形成这种芽结构。贾莫拉等人(2003)表明,这个过程是通过同时接收 2 个外部信号来实现的:一个 WNT 蛋白(WNT3A; 606359 ) 来稳定 β-连环蛋白,以及一个骨形态发生蛋白抑制剂(Noggin; 602991 ) 来产生 Lef1。β-连环蛋白结合并激活 Lef1 转录复合物,这些转录复合物似乎通过下调编码 E-钙粘蛋白的基因( 192090),极性和细胞间粘附的重要组成部分。当任何一个信号缺失时,功能性 Lef1 复合物都不会产生,并且 E-钙粘蛋白下调和卵泡形态发生受损。在果蝇中,E-钙粘蛋白可以影响细胞分裂平面和细胞骨架动力学。与这个概念一致,Jamora 等人(2003)表明强制升高 E-钙粘蛋白水平会阻止内陷和卵泡生成。贾莫拉等人(2003 年)得出结论,他们的研究结果揭示了一个复杂的分子程序,该程序将 2 个细胞外信号通路与核转录因子的形成联系起来,核转录因子作用于靶基因以重塑细胞连接并允许卵泡形成。

造血干细胞(HSC) 具有自我更新和产生所有血液谱系的能力。雷亚等人(2003)表明 WNT 信号通路在这一过程中具有重要作用。活化 β-连环蛋白的过度表达通过表型和功能扩展了长期培养物中的 HSC 库。此外,正常微环境中的 HSC 会激活 LEF1/TCF 报告基因,这表明 HSC 在体内对 WNT 信号传导有反应。为了证明该途径对 HSC 增殖的生理意义,Reya 等人(2003)表明轴蛋白(603816)或卷曲(603408)的异位表达) 配体结合域,WNT 信号通路的抑制剂,导致体外 HSC 生长的抑制和体内重组的减少。此外,HSC 中 WNT 信号传导的激活诱导 HOXB4( 142965 ) 和 NOTCH1( 190198 ) 的表达增加,这些基因以前与 HSC 的自我更新有关。雷亚等人(2003 年)得出结论,WNT 信号通路对于体外和体内正常的 HSC 稳态至关重要,并提供了对 HSC 发育调控的潜在分子层次的洞察。

内侧边缘上皮接缝的上皮间充质转化(EMT) 产生腭融合。Nawshad 和 Hay(2003)表明,Tgfb3( 190230 ) 通过刺激内侧边缘上皮细胞中Lef1 的表达,在小鼠中引起腭缝 EMT。TGFB3激活LEF1在经由核磷酸化Smad2(不存在β-联蛋白的601366)和Smad4(600993)。

EDAR( 604095 ) 通过激活 NF-kappa-B(见164011)通路在外胚层分化中发挥关键作用。Shindo 和 Chaudhary(2004)使用转染的人胚胎肾细胞和来自 NF-kappa-B 通路成分缺陷的小鼠胚胎的成纤维细胞表明,EDAR 信号传导抑制 LEF1-β-连环蛋白依赖性转录,而与其对 NF-kappa- 的刺激作用无关。 B 活动。此外,具有无汗性外胚层发育不良( 129490 ) 相关突变的EDAR在 NF-kappa-B 激活和 LEF1/β-连环蛋白抑制方面均表现出缺陷。由于 LEF1/β-catenin 控制 EDA( 300451 ) 的表达,结果表明 EDA-EDAR 轴的负反馈调节。

加尔塞兰等人(2004)发现小鼠Lef1在体外和体内与 Dll1( 606582 ) 启动子中的多个位点结合,并且 Lef1 位点的突变损害了胚胎小鼠前体中胚层中报告基因转基因的表达。

斯科科瓦等人(2006)发现先天性中性粒细胞减少症患者的停滞早幼粒细胞中 LEF1 表达显着降低或缺失(见202700)。LEF1 减少导致下游靶基因表达缺陷,包括 CCND1( 168461 )、MYC( 190080 ) 和 BIRC5( 603352 )。来自健康个体的早幼粒细胞表现出最高的 LEF1 表达。在 2 名先天性中性粒细胞减少症患者的早期造血祖细胞中重建 LEF1 导致这些祖细胞分化为成熟的粒细胞。竞争性结合和染色质免疫沉淀(ChIP) 分析表明 LEF1 直接结合并调节转录因子CEBPA( 116897)。研究结果表明LEF1在粒细胞生成中起作用。

在胚胎发生和肿瘤形成过程中,TCF/LEF 蛋白在 Wnt 信号通路中与 CTNNB1 形成转录单位。山田等人(2006)之前曾报道 NLK( 609476 ) 通过 TCF/LEF 蛋白的磷酸化负调节 Wnt 信号传导。通过酵母 2 杂交和免疫共沉淀分析,他们发现非洲爪蟾和人类 NARF(RNF138; 616319 ) 与 NLK 相互作用。NARF 泛素化 TCF4(TCF7L2; 602228) 和 LEF1,但不是 NLK,以剂量依赖的方式。包含野生型 NLK,但不包含激酶死亡 NLK,增强了 NARF 与 TCF4 或 LEF1 之间的相互作用。NLK 促进了 TCF4 和 LEF1 的 NARF 依赖性泛素化,并增强了蛋白酶体介导的 TCF4 和 LEF1 降解。报告基因分析证实,NARF 抑制了 Wnt 响应元件的 TCF/LEF 依赖性激活。非洲爪蟾胚胎中 Narf 的表达抑制了依赖于 Ctnnb1 的次级轴形成,并且敲低 HeLa 细胞中的 NARF 增强了 WNT3A 依赖的基因表达。山田等人(2006 年)得出结论,NARF 是 NLK 相关的 Wnt 信号负调节因子,它泛素化磷酸化的 TCF/LEF 蛋白,靶向它们进行降解。

加蒂诺尼等人(2009)报道Gsk3b( 605004 ) 或 Wnt3a抑制剂对 Wnt/β-连环蛋白信号传导的诱导阻止了小鼠 Cd8(见186910)阳性 T 细胞发育成能够产生细胞毒性或产生 Ifng( 147570 ) 的效应 T 细胞。相反,Wnt 信号促进了 Tcf7( 189908 ) 和Lef1 的表达以及能够增殖和抗肿瘤活性的自我更新的多能 Cd8 阳性记忆干细胞的产生。加蒂诺尼等人(2009)得出结论,Wnt 信号传导在维持成熟记忆 CD8 阳性 T 细胞的自我更新干细胞样特性方面具有关键作用。

使用 RT-PCR 和流式细胞仪分析,Zhao 等人(2010)证明小鼠 Tcf7 和 Lef1 在幼稚 T 细胞中高表达,在效应 T 细胞中下调,在记忆 T 细胞中上调。表达 p45 Tcf7 同种型和 β-连环蛋白的记忆 Cd8 阳性 T 细胞具有增强的 Il2( 147680 ) 生产能力和增强的清除单核细胞增生李斯特菌的效应器能力。赵等人(2010)得出结论,Wnt 通路的组成型激活有利于免疫期间记忆 CD8 T 细胞的形成,从而在第二次遇到相同病原体时增强免疫力。

Driessens 等人使用遗传方法(2010)没有发现β-连环蛋白通路调节 T 细胞记忆表型的证据,这与Gattinoni 等人的研究结果相反(2009)。Driessens 等人的研究结果(2010)表明Gattinoni 等人观察到的Cd8阳性记忆干细胞的产生(2009)使用 Gsk3b 抑制剂不是激活 β-连环蛋白途径的结果,而是由于激活了另一个 Gsk3b 依赖性途径。在答复中,Gattinoni 等人(2010)注意到其他人,包括赵等人(2010)和珍妮特等人(2010),还确定 Wnt 和 β-连环蛋白是胸腺后 Cd8 阳性 T 细胞分化和记忆发育的关键因素。使用蛋白质印迹分析,Gattinoni 等人(2010 年)表明,添加 Wnt3a 或 Gsk3b 抑制剂可稳定引发的 Cd8 阳性小鼠 T 细胞中的 β-连环蛋白。

▼ 基因结构

霍瓦内斯等人(2000)确定 LEF1 基因跨越至少 52 kb 并包含 12 个外显子。此外,2 个替代外显子(外显子 3a 和 3b)似乎位于内含子 3。5 素 UTR 富含 GC,并包含 4 个主要替代起始位点,其中第一个位于类似启动子的共有序列中。启动子区域不包含 TATA 框,但它具有 SP1( 189906 ) 结合位点、GAGA 位点和 E 框。

▼ 生化特征

爱等人(1995)报道了 LEF1 HMG 结构域和碱性区域及其 DNA 结合位点的复合物的溶液结构。他们发现LEF1结合通过其HMG结构域发生在小沟中。它会在 DNA 中产生一个急剧弯曲,从而促进其他转录因子与相邻序列的结合。

▼ 细胞遗传学

利维等人(2020)研究了 2 名不相关的患者,一名 23 岁的白人女性(P1) 和一名 6 岁的阿尔及利亚男孩(P2),患有外胚层发育不良(ED) 和包含 LEF1 基因的缺失。两名患者都表现出稀疏或纤细的头发,睫毛和眉毛稀疏或缺失,并且都有严重的乳牙和恒牙少牙,以及牛牙畸形和特定的牙槽骨缺损。Array-CGH 分析揭示了 P1 中染色体 4q25(chr4:108,587,425_109,095,006del, GRCh37) 的 508 kb 缺失,包括 LEF1 以及其他基因。P1 及其父母的 FISH 分析证实了缺失的从头起源。在已知 ED 相关基因突变阴性的 P2 中,SNP 分析检测到 4q25 处的 362-kb 缺失(chr4:108,978,450-109,340,680,GRCh37),也显示在先证者中重新发生。

▼ 测绘

通过对来自种间体细胞杂种组的 DNA 进行 Southern 印迹分析,Milatovich 等人(1991)将 LEF1 分配给 4cen-q31.2。他们通过原位杂交进一步细化了对 4q23-q25 的分配。通过对重组近交系的研究,将相应的基因分配给远端小鼠3号染色体。

▼ 分子遗传学

在使用高分辨率单核苷酸多态性(SNP) 阵列和基因组 DNA 测序对242 名小儿急性淋巴细胞白血病(ALL; 613065 ) 患者的白血病细胞进行全基因组分析时,Mullighan 等人(2007 年)在 40% 的 B 祖细胞 ALL 病例中发现了编码 B 淋巴细胞发育和分化的主要调节因子的基因突变。在LEF1,IKZF1(未检测到缺失603023),IKZF3(606221),TCF3(147141),和EBF1(164343)。PAX5( 167414 ) 基因是体细胞突变最常见的目标,在 31.7% 的病例中发生改变。

▼ 动物模型

Lef1 是一种序列特异性 DNA 结合蛋白,在成年小鼠的前 B 和 T 淋巴细胞以及小鼠胚胎发生过程中的神经嵴、中脑、牙胚、晶须毛囊和其他部位中表达。范 Genderen 等人(1994)产生了携带 Lef1 基因纯合种系突变的小鼠,该突变消除了 Lef1 蛋白的表达并导致出生后死亡。突变小鼠没有牙齿、乳腺、胡须和毛发,尽管它们发育出基本的毛囊。Lef1 缺陷小鼠也缺乏三叉神经的中脑核,这是唯一的神经嵴衍生的神经元群。突变小鼠在出生时没有表现出明显的淋巴细胞群缺陷。范 Genderen 等人(1994) 表明 Lef1 在需要诱导组织相互作用的几个器官和结构的形成中起重要作用。

为了测试 LEF1 模式是否对头发模式和形态发生具有重要的功能,Zhou 等人(1995)使用转基因技术来改变小鼠表面外胚层上人类 LEF1 表达的模式和时间。毛囊的定位和方向出现了惊人的异常,使这种通常均匀的图案明显中断。此外,发育中的转基因小鼠唇沟上皮细胞中 LEF1 水平升高会触发这些细胞内陷,有时会导致毛囊和牙齿细胞命运的不适当采用。

Kratochwil 等人(2002)研究了 LEF1 在牙齿发育过程中诱导信号传导的功能,并得出结论认为 FGF4( 164980 ) 是Lef1和 Wnt 信号传导的直接靶标。他们观察到 Lef1 缺失小鼠(Van Genderen 等人,1994 年)中发育停滞的牙齿残基未能表达 Fgf4、Shh(600725)和 Bmp4(112262)。Kratochwil 等人(2002)生成了携带突变以消除 LEF1 与 CTNNB1 相互作用的小鼠,并得出结论,LEF1 在牙齿发育中的作用取决于其与 CTNNB1 和 Wnt 信号传导的相互作用。他们表明,用重组 FGF4 蛋白浸泡的珠子可诱导上皮细胞中 Shh 的延迟表达,并可以完全克服 Lef1 缺陷牙胚的发育停滞。使用 FGF 信号的化学抑制剂,他们能够模拟在 Lef1 缺陷小鼠中观察到的牙齿发育停滞。Kratochwil 等人(2002)假设 LEF1 在牙发育过程中的唯一功能可能是激活 Fgf4 并在特定发育阶段连接 Wnt 和 FGF 信号通路。

通过将细菌 β-半乳糖苷酶基因框内插入编码Lef1的 DNA 结合域的外显子,Galceran 等人(2004)创造了表达截短形式的 Lef1 的小鼠,这种形式可以与 β-连环蛋白相互作用,但不能结合 DNA。纯合突变小鼠围产期死亡。脊柱和胸腔严重畸形,表明Lef1参与了近轴中胚层的生成和模式化。突变胚胎表现出体节融合、体节的喙尾模式缺陷以及神经嵴衍生的脊神经缺乏或路线错误。他们还表现出发育调节的转录因子的异常表达。

▼ 等位基因变体( 1 示例):

.0001 皮脂腺肿瘤,体细胞
LEF1、GLU45LYS 和 SER61PRO
在来自 14 个人类皮脂腺瘤中的 5 个和 6 个人类皮脂腺瘤中的 2 个的肿瘤组织中,Takeda 等人(2006 年)在同一等位基因上的 LEF1 基因的外显子 1 中鉴定了 2 个体细胞突变:133G-A 转换,导致 glu45-to-lys(E45K) 取代,以及 181T-C 转换,导致 ser61- to-pro(S61P) 替换。体外功能表达研究表明,这些突变损害了 LEF1 与 β-连环蛋白(CTNNB1; 116806 ) 的结合和转录激活,并使 Wnt 信号失活。突变体LEF1不仅抑制了β-catenin靶基因的表达,而且刺激了皮脂细胞标志物的表达,表明它可能决定了皮脂腺肿瘤的分化特征。