半胱天冬酶 9，凋亡相关半胱氨酸蛋白酶; CASP9

凋亡蛋白酶激活因子3；APAF3

HGNC 批准的基因符号：CASP9

细胞遗传学定位：1p36.21 基因组坐标（GRCh38）：1:15,491,400-15,524,911（来自 NCBI）

▼ 克隆与表达

Li et al.（1997）报道了从 HeLa 细胞中纯化出第三种凋亡激活因子 APAF3，该因子参与体外半胱天冬酶-3（600636）激活。APAF3 被鉴定为半胱天冬酶家族的成员并指定为半胱天冬酶-9（CASP9）。

▼ 生化特征

晶体结构

盐崎等人（2003）以 2.4 埃的分辨率报道了与 XIAP 的 BIR3 结构域形成的抑制复合物中半胱天冬酶-9 的晶体结构。该结构表明 BIR3 结构域与半胱天冬酶-9 单体形成异二聚体。与 BIR3 相互作用的半胱天冬酶-9 表面也介导其同源二聚化。由于缺乏同源二聚化提供的支持序列元件，单体半胱天冬酶-9 没有催化活性。作者得出结论，XIAP 以单体状态隔离半胱天冬酶-9，从而阻止催化活性。

▼ 基因功能

Li 等人（1997）确定在细胞色素 c（123970）和 dATP 存在的情况下，半胱天冬酶-9 和 APAF1（602233）通过各自的 NH2 末端 CED-3 同源结构域相互结合，这一事件导致半胱天冬酶-9 激活。激活的半胱天冬酶-9 依次裂解并激活半胱天冬酶-3。S-100 提取物中半胱天冬酶-9 的耗尽会减少半胱天冬酶-3 的激活。半胱天冬酶-9 活性位点的突变（cys287 至 ala）减弱了半胱天冬酶-3 的激活和体内细胞凋亡反应，表明半胱天冬酶-9 是由细胞色素 c 和 dATP 触发的凋亡蛋白酶级联的最上游成员。

APAF1 在细胞色素 c/dATP 依赖性途径中激活 pro半胱天冬酶-9，需要蛋白水解裂解才能生成成熟的半胱天冬酶分子。斯里尼瓦苏拉等人（1998）表明，删除 APAF1 WD40 重复序列使 APAF1 具有组成型活性，并且能够孤立于细胞色素 c 和 dATP 处理 pro半胱天冬酶-9。APAF1 介导的 pro半胱天冬酶-9 加工通过 pro半胱天冬酶-9 本身的内在自催化活性发生在 asp315。斯里尼瓦苏拉等人（1998）提供的证据表明 APAF1 可以形成寡聚体，并且可以通过寡聚化其前体分子来促进 pro半胱天冬酶-9 自激活。一旦激活，半胱天冬酶-9 可以启动涉及下游刽子手半胱天冬酶-3、-6 和 -7 的生化级联反应。

XIAP（300079）与半胱天冬酶-9 相互作用并抑制其活性，而 SMAC（605219）通过与 XIAP 相互作用缓解这种抑制。斯里尼瓦苏拉等人（2001）证明 XIAP 通过与半胱天冬酶-9 小亚基上连接肽的氨基末端结合而与活性半胱天冬酶-9-APAF1 全酶复合物结合，在 pro半胱天冬酶-9 在 asp315 处进行蛋白水解加工后，该小亚基会暴露出来。支持这一观察结果的是，点突变消除了半胱天冬酶-9 的蛋白水解过程，但没有消除其催化活性，或连接肽的删除，阻止了半胱天冬酶-9 与 XIAP 的关联及其伴随的抑制。斯里尼瓦苏拉等人（2001）指出半胱天冬酶-9 连接肽的 N 端 4 个残基与成熟 SMAC 和果蝇蛋白 Hid/Grim/Reaper 中的 N 端四肽具有显着的同源性，定义了一类保守的 IAP 结合基序。与这一发现一致，半胱天冬酶-9 连接肽和 SMAC 与 XIAP 的 BIR3 结构域的结合是相互排斥的，表明 SMAC 通过破坏半胱天冬酶-9 连接肽与 BIR3 的相互作用来增强半胱天冬酶-9 活性。斯里尼瓦苏拉等人（2001）得出的结论是，他们的研究揭示了一种机制，其中 2 个保守肽（一个来自 SMAC，另一个来自半胱天冬酶-9）与 XIAP 的 BIR3 结构域结合，对半胱天冬酶活性和细胞凋亡具有相反的作用。半胱天冬酶-9 连接肽和 SMAC 与 XIAP 的 BIR3 结构域的结合是相互排斥的，表明 SMAC 通过破坏半胱天冬酶-9 连接肽与 BIR3 的相互作用来增强半胱天冬酶-9 活性。斯里尼瓦苏拉等人（2001）得出的结论是，他们的研究揭示了一种机制，其中 2 个保守肽（一个来自 SMAC，另一个来自半胱天冬酶-9）与 XIAP 的 BIR3 结构域结合，对半胱天冬酶活性和细胞凋亡具有相反的作用。半胱天冬酶-9 连接肽和 SMAC 与 XIAP 的 BIR3 结构域的结合是相互排斥的，表明 SMAC 通过破坏半胱天冬酶-9 连接肽与 BIR3 的相互作用来增强半胱天冬酶-9 活性。斯里尼瓦苏拉等人（2001）得出的结论是，他们的研究揭示了一种机制，其中 2 个保守肽（一个来自 SMAC，另一个来自半胱天冬酶-9）与 XIAP 的 BIR3 结构域结合，对半胱天冬酶活性和细胞凋亡具有相反的作用。

马斯登等人（2002）确定 BCL2（151430）控制的细胞死亡途径不需要半胱天冬酶-9 或其激活剂 APAF1。他们的证据表明，两者都不是造血稳态所必需的（BCL2 家族在造血稳态中起主要作用），具有自身反应性的胸腺细胞的删除取决于 BIM（603827），而不取决于 APAF1。因为 APAF1 或半胱天冬酶-9 的缺失最多会稍微延迟细胞凋亡，Marsden 等人（2002）得出结论，凋亡体不是细胞凋亡的重要触发因素，而是放大半胱天冬酶级联的机器。他们发现 BCL2 过度表达会增加小鼠的淋巴细胞数量并抑制许多细胞凋亡刺激，但 APAF1 和半胱天冬酶-9 的缺失却不会。在缺乏 APAF1 或半胱天冬酶-9 的细胞中，半胱天冬酶活性仍然可辨别，而有效的半胱天冬酶拮抗剂既能抑制细胞凋亡，又能延缓细胞色素 c 的释放。马斯登等人（2002）得出结论，BCL2 孤立于细胞色素 c/APAF1/半胱天冬酶-9 凋亡体调节半胱天冬酶激活程序，这似乎是放大而不是启动半胱天冬酶级联。

CASP9 活性在与凋亡体复合物结合后急剧增加。尹等人（2006）和 Pop 等人（2006）证明凋亡体通过诱导接近引起其二聚化来激活 CASP9。此外，尹等人（2006）发现凋亡体通过直接与 proCASP3 相互作用或通过诱导结合的 CASP9 的构象变化来增强 CASP9 对 proCASP3 的亲和力。

周等人（2009）提出了一组经过高度验证的靶标，这些靶标对于果蝇中几种刺激引起的细胞凋亡是必需的。其中，Tango7（其人类同源物是PCID1（609641））被确定为新的效应子。缺乏该基因的细胞在诱导效应半胱天冬酶活性之前的一个步骤中抵抗细胞凋亡，果蝇中 Tango7 的定向沉默可防止半胱天冬酶依赖性程序性细胞死亡。与该模型系统中已知的凋亡调节因子不同，Tango7 活性并不影响果蝇 DIAP1（人类同源物 DIAPH1，602121）的刺激依赖性损失，而是调节顶端半胱天冬酶 Dronc（人类同源物 CASP9）的水平。同样，Chew 等人（2009）发现人类 PCID1 影响半胱天冬酶-9，揭示了影响凋亡体的新调控轴。

▼ 基因结构

Hadano 等人（1999）确定 CASP9 基因包含 9 个外显子，跨越大约 35 kb 的基因组 DNA。

▼

FISH、Hadano 等人绘制的地图（1999）将 CASP9 基因定位到染色体 1p36.3-p36.1。

▼ 动物模型

Kuida 等（1998）通过靶向破坏人类 CASP9 基因的小鼠同源物培育出小鼠。大多数 Casp9 敲除小鼠在围产期死亡，其大脑明显增大且畸形，这是由于大脑发育过程中细胞凋亡减少所致。Casp9 缺失可阻止体内胚胎大脑中 Casp3 的激活，并且 Casp9 缺陷的胸腺细胞表现出对部分凋亡刺激的抵抗力，包括缺乏 Casp3 样裂解和延迟的 DNA 片段化。此外，Casp9 缺陷细胞的胞浆提取物中不存在细胞色素 c 介导的 Casp3 裂解，但在添加体外翻译的 Casp9 后又恢复了。这些结果表明 Casp9 是体内半胱天冬酶级联的关键上游激活剂。

哈克姆等人（1998）还创建了 Casp9 被破坏的基因敲除小鼠。Casp9 -/- 胚胎干细胞和胚胎成纤维细胞对多种细胞凋亡刺激具有抵抗力，包括紫外线和伽马射线照射。Casp9 -/- 胸腺细胞也能抵抗地塞米松和伽马射线照射诱导的细胞凋亡，但对紫外线照射或抗 CD95 诱导的细胞凋亡敏感。突变细胞中线粒体膜电位的保留伴随着细胞凋亡的抵抗。此外，在紫外线刺激下，细胞色素 c 易位至 Casp9 -/- 胚胎干（ES）细胞的胞质溶胶中，表明 Casp9 在细胞色素 c 的下游发挥作用。半胱天冬酶加工在 Casp9 -/- ES 细胞中受到抑制，但在胸腺细胞或脾细胞中不受抑制。