植入前遗传学检测在反复妊娠丢失中的应用
作者：路瑶，孙贇
基金项目：上海市领军人才计划（SSMU-ZLCX20180401）；上海市教育委员会高峰高原学科建设计划（20161413）；上海市科技创新行动计划（18140902400）
作者单位：上海交通大学医学院附属仁济医院生殖医学中心 上海市辅助生殖与优生重点实验室，上海200135
通讯作者：孙贇，电子信箱：syun163@163.com
反复妊娠丢失（recurrent pregnancy loss，RPL）是困扰育龄期女性的常见疾病。引起RPL的可能原因包括胚胎因素、遗传因素、宫腔因素、免疫因素、内分泌因素等。其中，胚胎染色体异常所致的流产占50%～70%，是目前公认的引起RPL的最常见因素。据报道，RPL患者胚胎染色体异常以胚胎非整倍体为主，发生率可达70%～80%；其余异常包括多倍体、拷贝数变异、单亲二倍体等。
植入前遗传学检测（preimplantation genetic testing，PGT）指在辅助生殖技术过程中，在胚胎植入子宫前，对其进行遗传学检测，选择正常或不致病的胚胎进行移植，以降低遗传性疾病患儿的出生率。早期的PGT技术根据临床目的分为植入前遗传学诊断（preimplantationgenetic diagnosis，PGD）和植入前遗传学筛查（preimplantation genetic screening，PGS）。2017年，国际辅助生殖技术监控委员会重新规范了PGT相关技术的命名，现统一为：对非整倍体的检测（PGT for aneuploidies，PGT-A），对染色体结构异常的检测（PGT for chromosomal structural rearrangements，PGT-SR），以及对单基因遗传病的检测（PGT formonogenic/single gene defects，PGT-M）。可见，对于因胚胎非整倍体、亲代染色体异常等引起RPL的患者，可采用PGT辅助生殖，以降低流产率。本文将围绕PGT技术在RPL患者中的应用进展做一综述。
1 PGT检测技术的进展
聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术是最早应用于PGT检测的传统技术，可用于单基因遗传病的检测。但由于诊断效率低、样本污染概率高等局限性，目前已几乎不用于胚胎检测。荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）是早期应用最多的PGT检测方法，通过荧光染色，可以直观地检测出染色体的数目及结构异常。然而FISH需要根据不同染色体易位断裂位点设计特异性探针，只能对有限的染色体进行检测（5～14对），故临床应用局限性较大。随着PGT技术的推广，可以检测24条染色体的全部染色体筛查（comprehensive 染色体screening，CCS）技术成为临床应用的必然需求。
目前，可用于CCS的检测技术包括：微阵列比较基因组杂交（array comparative genomic hybridization，aCGH）、微阵列单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism array，SNParray）、二代测序（next generation sequencing，NGS）和定量聚合酶链式反应（quantitative PCR，qPCR）。aCGH是第一个能进行CCS的检测技术，通过各个染色体片段的杂交信号判断是否存在染色体异常；aCGH可检测全部的染色体非整倍体，且检测方便快捷，仅需12～15 h。SNP array通过对芯片上参考基因组和标本基因组的约30万个SNP位点进行比较，可以检测全部的染色体非整倍体、单基因遗传病和单亲二倍体。近年来，NGS技术不断改进，因其通量高、信息量丰富、成本低等优势得到广泛应用，NGS技术能检测全部的染色体非整倍体、4Mb以上的微缺失/微重复，并能识别嵌合体（包含正常细胞和异常细胞的胚胎）。qPCR技术在传统PCR技术的基础上进行DNA靶向扩增，同时进行扩增产物的定量和监测，也可用于CCS检测。
大多数临床证据显示，CCS技术的应用可以改善辅助生殖技术的妊娠结局；然而，目前的检测技术仍存在一定局限性。aCGH、SNP array、NGS技术均以全基因组扩增（whole genome amplification，WGA）技术为基础，WGA技术的局限性可能引起检测结果偏差。aCGH、SNP array技术不能检测芯片覆盖区域以外的染色体异常。aCGH、NGS技术不能检测多倍体。qPCR技术对染色体的分辨率较低，难以检测部分性非整倍体，故临床应用较少。此外，这些技术均难以区分正常核型与染色体易位携带者核型的整倍体胚胎。
2010年，有学者首次提出了karyomap技术，该技术在SNP array的基础上，进行基于遗传标记的家系单体型连锁分析，可区分正常核型胚胎与易位携带者胚胎，并可用于单基因遗传疾病的检测。该技术的问世满足了易位携带者亲代挑选正常核型胚胎的临床需求，进一步降低了易位携带者子代反复流产、不孕的发生风险。
2 PGT胚胎活检时期的进展
胚胎活检的时期包括极体活检、卵裂期活检和囊胚期活检3种。极体活检在1990年已应用于临床，是所有活检中最安全的技术，但是因其只能间接推断卵母细胞基因型、无法检测父源染色体与父源等位基因以及检测误差高等缺点，而未能广泛应用于临床。
卵裂期活检是世界上最早使用的胚胎活检技术，通常于胚胎发育的第3天取1～2个卵裂球细胞进行检测。在PGT技术发展的前10余年，卵裂期活检的临床应用最为常见。此后，越来越多的研究显示，卵裂期活检可能影响胚胎后续发育，降低妊娠率；卵裂期活检还存在胚胎嵌合体比例高、检测样本少等问题，故误诊率较高，临床应用不断减少。
随着囊胚培养等实验室技术的不断完善，囊胚移植的成功率不断提高，为囊胚期活检创造了条件。囊胚期胚胎细胞分化出内细胞团和滋养细胞，其中内细胞团发育成胎儿，滋养细胞发育成胎盘等胎儿附属物。囊胚期活检通常在胚胎发育的第5～6天取5～10个滋养细胞进行检测。研究证实囊胚期滋养细胞与内细胞团检测结果一致率达96.1%。囊胚期活检可检测样本多，胚胎嵌合体比例降低，可减少误诊概率，且不影响胚胎种植率，因此已成为目前临床最常用的PGT检测手段。
3 PGT技术在RPL中的临床应用
无论是自然受孕还是辅助生殖技术，早期人类胚胎中的染色体异常发生率都较高。存在染色体拷贝数异常或染色体结构重排的细胞会损害胚胎的生存能力。人类的自然生育能力下降，以及辅助生殖技术的低成功率也可归因于这些细胞遗传学缺陷。染色体异常也导致了很大一部分胚胎流产和先天性疾病，这也是需进行PGT-A和PGT-SR技术的原因。现代方法不仅能够检测整个染色体异常（例如单染色体/三体），还具有更多的功能。技术上的进步以及分辨率和灵敏度的提高，使得人们可以鉴定出更多的胚胎染色体异常，例如嵌合体、片段缺失/重复等。PGT-M技术可对致病基因进行筛选，能更加精准地在整倍体胚胎中剔除可能致病的胚胎，进一步降低出生缺陷的风险。
3.1 PGT-A在RPL中的应用 胚胎非整倍体是引起RPL的最常见因素。已有研究发现，RPL患者与因性别选择行PGT-A的对照组患者相比，胚胎非整倍体发生率显著升高，约为对照组的1.33倍。近期，Liu等发现在35岁以下的女性中，不明原因RPL患者的胚胎非整倍体率较同年龄段的非RPL患者也显著升高（48.9% vs. 36.9%，P＜0.001）。既往有胚胎染色体异常史或合并卵巢功能下降的患者中，胚胎非整倍体发生率进一步升高。这些证据提示，RPL是胚胎非整倍体发生率升高的孤立危险因素，为PGT-A的临床应用提供了理论基础。
由于FISH检测技术的局限性，早期基于FISH平台的PGT-A对RPL的治疗有效性存在较大争议，包括2009年美国妇产科医师协会（AGOG）、2010年欧洲人类生殖与胚胎学学会均认为尚无证据显示PGT-A可改善RPL患者的获益。目前，随着CCS技术的发展及推广，多数研究认为PGT-A技术可能改善RPL患者的妊娠结局。2016年，Murugappan等回顾性研究发现，在RPL患者中行基于aCGH的PGT-A相比常规辅助生殖可显著降低流产率（14% vs. 50%，P=0.003），提高活产率（36% vs. 15%，P=0.01）；研究同时随访了RPL患者PGT-A与自然妊娠6个月内的妊娠情况，发现两组流产率、活产率差异均无统计学意义，然而PGT-A组患者年龄显著高于自然妊娠组［（37.1±4.1）岁 vs.（35.7±3.9），P=0.004］是重要的混杂因素。2019年，有回顾性研究发现，以供卵患者（平均年龄24.8岁）为对照，发现RPL患者（平均年龄34.8岁）行PGT-A后所获得每移植周期的活产率与年轻供卵周期的活产率相比差异无统计学意义（P=0.94），提示PGT-A有助于提高RPL患者的妊娠结局。同年，Sato等报道的平行队列研究前瞻性纳入年龄匹配RPL患者共92例（PGT-A组42例，对照组50例），结果发现基于NGS平台的PGT-A辅助生殖技术相比对照组每移植周期的生化妊娠流产率显著降低（12.5% vs. 45.0%，P=0.03），流产率无明显下降（14.3% vs. 20.0%，P=0.68），PGT-A组每移植周期的活产率较对照组显著升高（52.4% vs. 21.6%，P=0.03），每取卵周期的累积活产率无显著差异（26.8% vs. 21.1%，P=0.60）。此外，据Sundheimer等单中心研究报道，2013—2017年间有8例夫妇因RPL行PGT后发现亲代染色体存在平衡易位携带。可见，相比自然受孕，PGT-A对RPL患者还存在一定的诊断价值，有助于进一步了解患者胚胎发育、非整倍体发生率等因素。
3.2 PGT-SR在RPL中的应用 据报道，RPL夫妇中一方染色体异常的发生率为3%～8%；常见的染色体异常包括染色体相互易位、罗氏易位、倒位、数目异常等，均会导致胚胎非整倍体发生率升高。值得注意的是，既往亲代染色体异常的诊断均基于染色体核型分析。2019年，Dong等在1077例RPL夫妇中的研究发现：仅使用染色体核型诊断亲代染色体异常的概率为7.1%（76/1077），染色体核型结合基因组测序技术诊断亲代染色体异常的概率升高至11.7%（126/1077），可见使用染色体核型诊断亲代染色体异常的漏诊率高达4.6%（50/1077）（8例平衡易位和42例倒位）。由此推断，亲代平衡型染色体异常导致RPL的发病率可能较报道更高。
目前已有较多临床研究显示，因亲代染色体异常导致RPL的患者使用PGT辅助生殖可改善妊娠结局。2019年，Huang等进行的回顾性队列研究纳入194对染色体相互易位的RPL夫妇，发现行基于aCGH平台的PGT-SR后，胚胎整倍体率（正常型/平衡型）为26.7%，每移植周期的临床妊娠率为58.8%，每妊娠周期活产率88.6%，PGT-SR后相比自然受孕可显著降低流产率（83.8% vs. 11.0%）及出生缺陷发生率（6.1% vs. 3.4%）。同年，Cai等回顾性研究报道，134对染色体相互易位的夫妇中，基于NGS平台的PGT-SR辅助生殖后，平衡型整倍体胚胎率为27.3%，临床妊娠率65.4%，流产率2.5%。可见对于染色体平衡易位的RPL夫妇，基于aCGH、NGS平台的PGT辅助生殖是有效、可靠的生育选择。此外，Zhang等首次报道了Karyomap在11对平衡易位携带者夫妇中的应用，共活检囊胚68枚，其中平衡型整倍体胚胎26枚，正常核型胚胎14枚，移植后行产前诊断证实胎儿核型与检测结果一致。基于Karyomap的PGT临床应用让阻断平衡易位携带者的传递成为可能，进一步保障了子代安全性，为优生优育提供了另一有效选择。
3.3 PGT-M在RPL中的应用前景 胚胎染色体异常中约70%为非整倍体，其余的妊娠丢失虽具有整倍体核型，但可能存在目前常规检测不能发现的遗传学改变。在出现结构畸形和发育障碍的不良孕产史中应用全外显子组测序（WES）和染色体基因芯片分析的研究已经展现了这些技术在这类患者中潜在的临床应用价值。多项研究发现，整倍体胚胎的早期妊娠丢失可能与单基因遗传病相关。据2019年最新的系统综述报道：共纳入13项WES研究，其中8项对夫妇一方进行WES检测，6项进行家系WES检测，发现KIF14复杂杂合突变与不明原因整倍体流产相关；在4对夫妇、7次整倍体流产中发现DYNC2HI和ALOX15复合杂合突变。另外，ECEL1纯合子错义突变、MuSK纯合突变、STIL复杂杂合突变、CEP55纯合无义突变、IFT122复杂杂合突变等也可能与反复整倍体妊娠丢失相关。
可见，对流产物、引产胎儿和亲代双方进行家系WES检测可用于鉴定导致RPL和（或）胎儿异常的基因变异；如果遗传自父母，可以为产前诊断及PGT提供宝贵的信息；对于致病性变异，可进行PGT-M挑选不致病的胚胎，以降低反复流产的风险。利用WES及PGT技术，有助于提高我们对于人类早期胚胎致死性原因的探索和理解，但目前仍需进行较大规模的无偏倚队列研究来最终确定该组患者的检出率和WES的临床价值。
4 PGT技术的局限性
值得注意的是，PGT技术的临床应用尚存在一定的局限性及伦理风险。胚胎活检作为一种侵入性操作，是否会影响胚胎质量及发育潜能，仍需对PGT辅助生殖技术出生的子代进行长期随访，以评估PGT技术的安全性。检测结果的假阳性、嵌合体胚胎的认识不足，可能导致潜在的胚胎浪费。
此外，根据2015年Murugappan等团队对PGT-A技术的经济-效益评估，发现PGT-A获得活产的花费是自然受孕的100倍。RPL患者常面临紧张、焦虑等精神压力，PGT技术增加了等待胚胎检测结果的过程，还可能减少患者的移植机会，难以评估其是否会增加患者不安、失落等负面情绪。
5 小结与展望
PGT技术诞生30年以来，在染色体病、胚胎非整倍体检测、单基因遗传病等方面得到了广泛应用，在阻断异常染色体和致病基因的子代传递，降低流产和出生缺陷发生风险等方面显示出了广阔的应用前景。随着PGT检测技术和胚胎活检技术的不断完善，目前，多数研究认为PGT可以改善RPL患者的妊娠结局。但既往研究仍存在样本量小、非随机设计等问题，且部分研究结论存在争议；PGT技术的远期安全性亦证据不足，临床应用还需谨慎。此外，虽然PGT技术不断完善，但胚胎存在嵌合体及检测技术局限性等问题仍不容忽视，行PGT辅助生殖技术的患者在妊娠中期需要进行有创产前诊断以明确胎儿的遗传信息。未来，需要探索更加快捷、精准的PGT检测技术，以便缩短患者等待时间，降低检测成本，减少误诊漏诊概率，进一步改善RPL患者的妊娠结局（参考文献略）
