如何建立离子交换层析模型提高纯化效率

在用于纯化生物药物产品的各种下游纯化处理单元操作中，层析法能够提供产品与其他密切相关的产品变体和杂质之间较高的分离度。这种特异性与需要高纯度标准的生物药物的生产与纯化工艺密切相关。但是，由于可能影响纯化步骤性能的大量工艺参数，为开发和优化工艺层析步骤带来了重大挑战。例如，对于常用的离子交换层析，pH、离子浓度、梯度和固定相会影响回收步骤以及最终产物的质量。

对于复杂的纯化单元操作（例如工艺过程中的多步骤层析），建模可以帮助开发用于过程开发，监视和控制的系统方法。还可以明智地使用所建立的模型来减少实验室实验数量，从而显着减少所需的时间和工艺过程开发期间的成本。随着QbD的应用，人们已经做出了新的努力，以通过对关键生物过程纯化单元操作的建模来获得对工艺过程更深入的了解。

研究人员已经尝试了多种层析建模的方法。好的模型的基本要求是要具有预测性，并且至少能够解释数据中的大多数可变性。另外，该模型对于在工业环境中的实施应该是可行的。常用的建模方法可以大致分为两类。第一类是经验建模，其中使用基于实验设计（DOE）等方法的实验数据来构建模型。第二类是机械建模，其中模型是建立在系统的基本过程之上的。基于DOE的方法主导着行业中的建模工作，并且在提供过程经验和确定设计空间方面可能是非常有效的。然而，由于经验模型没有包含潜在的纯化机制，因此它们在准确性和一致性方面会受到影响。相反，机械模型可提供出色的可预测性。所以它们比经验模型更受青睐，但大多数层析操作的复杂性并不适合于机械建模和模型的混合。机械建模的传统方法需要大量的实验数据，以致其在工业中的使用受到严重限制。

通常，模型用于预测和优化工艺过程的变量，例如淋洗或洗脱曲线。通常需要进行详细研究和试验，以检查保留和容量如何随不同过程变量而变化。除了保留和峰分布的预测之外，机械模型还可以用于开发有效的优化策略以及层析中梯度洗脱的稳定性测试。

建模的先决条件
随着有效数值方法的最新发展，建立一个复杂而详细的力学模型是可行的，该模型能够描述层析树脂中珠粒级别的物质传递，并且可以使用计算机来执行。离子交换层析（IEC）是纯化生物药物的主要工具。机械模型的开发需要三个主要步骤：物质传递建模，结合建模以及最后的机械模型验证。细节的选择取决于所需的可预测性。

物质传递模型
尽管模型具有不同的详细程度，但已使用数学模型描述了层析柱填充床内各个相之间溶质的传输。机械建模需要解决质量平衡方程，这通常是使用数值方法实现的。随着所需精度的提高，用于模型的偏微积分方程数值的需求也随之增加。广义地讲，在层析珠水平上，物质传递限制存在四个边界，即通过在珠子颗粒周围的薄膜层（k膜）的外部质量传递，通过孔（D孔）和表面（Ds）的扩散以及结合位点的反应速率。物质之间传递交换模型的完整描述通常使用通用速率模型（Generalized regression model，GRM）的形式建立，该模型涵盖了k膜，D孔，Ds，反应速率之间的关系。但是，GRM的数值解决方案需要大量计算。随着新的，优化的数值计算器和现成工具（例如CADET和chromX）的出现，过去几年来GRM研究人员的使用率有所增加。相反，许多研究人员选择使用不太复杂的模型，例如转移传递分散模型（TDM）。在该模型中，内部和外部的传质阻力被集中到一个有效的传递系数中。层析结构中下一个最简单的模型是集总率模型（LRM）。在该模型中，速率动力学和质量输运集中在一个参数中，并且假定在孔隙和固体中的扩散是无限的。LRM是已被广泛用于建模的最简单模型。

图1：层析柱中溶质通过珠粒的传输示意图。常用的方程式及其相关条件如图1所示。

建立模型的选择
IEC建模的一个关键方面是蛋白质结合模型的选择。文献中提供了数十种吸附模型。大多数模型都基于Langmuir模型或化学计量位移模型（SDM）。在Langmuir模型中，基于盐的离子交换系统的流动相相互作用模型更为常见。空间质量作用模型是化学计量位移模型的常用选择。许多研究人员还使用了基于Mollerup公式的基于热力学的吸附模型。最近，pH和温度依赖性也已被纳入该模型。最近，基于分子结构的更详细的模型也已被应用。下表1总结了不同模型及其在最近出版的文献中的使用。绑定模型的选择主要取决于确定模型参数的简易性和准确性。

表1：最近几年使用的传质模型及其各自的结合模型。SMA：空间质量作用，SDM：化学计量位移模型，LGE：线性梯度洗脱。

模型参数的建立
模型开发中的最大挑战在于收集对模型中使用的各种参数的准确估计。模型参数可以分为三大类，即柱参数、传质系数和结合参数。层析柱参数与层析反应无关，并且易于确定。它们由柱孔和孔隙度组成。通常，这些孔隙率是使用蛋白质样品或合适的追踪剂的非结合条件估算的。第二类是传质系数。这些由层析柱轴向分散（Dax），k膜，D孔和Ds组成。如果不使用GRM，则不需要对D孔隙和Ds进行单独估计。其余的传质系数可以使用相当于理论塔板（HETP）或Yamamoto线性梯度洗脱（LGE）方法的高度进行估算。没有估计D孔和Ds的特定方法对于GRM的适用性有一定的影响。在大多数情况下，使用理论估计或逆拟合方法。使用柱外吸收批处理实验或柱上注入以及通过流动相调节剂或梯度洗脱来估计结合参数。可以通过保留峰值最大值来进行粗略估计，并且可以使用反拟合方法进一步完善。

层析方法估计设定参数的方法都有其优点和缺点。虽然批次实验易于执行且不会干扰传质参数，但这种方法在溶质浓度非常低的样品中缺乏准确性。对于使用层析柱方法，测量是准确的，但是这些方法受传质参数测量的干扰。上表1中列出了不同的，最近使用的传质和结合模型的摘要。在以下部分中，将对IEC模型中的单克隆抗体（mAb）进行案例研究。

用于开发纯化单克隆抗体的离子交换层析步骤的机械模型
我们提供了使用开放源层析设计和分析工具（CADET，https://github.com/modsim/CADET）建立离子交换机理模型的分步方法。此方法中使用的机械模型是GRM，以及使用盐梯度作为流动相调节的扩展Langmuir模型。使用逆方法确定参数。在此方法中，重要的是将所有死体积和延迟体积都包括在模型中，以描述实际的保留时间，并分别考虑层析中的分散和层析柱的谱带展宽。例如，可以将管道和检测器的死体积建模为一系列分散的活塞流和连续反应器。一个典型的设置如下图2所示，并在参考文献中进行了更详细的描述。一旦与CADET一起设置了模型，确定模型参数的步骤如下。

图2：生物反应器系统模型的典型设置以及层析柱。延迟量建模为连续搅拌釜（CSTR）和分散活塞流（DPFR）反应器的链。DPFR具有长度和分散系数作为参数。该系统捕获了额外的层析柱体积以及系统的分散效果，因此可以测量进出层析柱累积的蛋白质和盐分布。

步骤1：估计Äkta层析仪参数
应当使用零体积连接器来确定Äkta层析仪外部体积的流量参数，以代替层析柱。然后可以在不使用层析柱的情况下注射蛋白质样品以生成输出流量曲线。此配置文件可用于计算系统的分散度，管道，混合物和检测器的停留时间。

步骤2：估算层析柱流动参数
一旦估算了系统参数，即可连接床高5cm的预填充层析柱。然后可以注入具有高Na+含量的蛋白质样品，以使蛋白质不与层析树脂相互作用（非结合条件）。通过使用带有参数试验值的CADET模拟将输出轮廓与估算轮廓拟合，可以将所得数据用于计算层析柱孔隙度和分散度。

或者，可以注入合适的追踪剂，一种比珠子的孔小，而另一种比珠子的孔大的混合物，并且可以从追踪剂的保留时间直接计算孔隙率。可以使用HETP（高度等于理论塔板）图在不同流速下估算轴向弥散系数。

步骤3：传质参数和结合参数的估计
结合参数和内部传质系数可以通过注入出口通过逐步洗脱和梯度洗脱的组合获得。由于mAb产物可能包含不同的变体，因此重要的是分离单个变体的峰，或者可以使用高效液相色谱（HPLC）分析从收集的馏分中为单个变体重建峰（下图3）。然后可以将重建的峰用于将模拟轮廓与CADET中提供的试验参数值进行拟合。吸附和传输参数的试验值可以使用峰图在各种盐浓度下逐步洗脱来估算。可以使用在自由扩散和孔扩散率之间中可用的相关性来估计孔扩散。或者，可以对分离的峰进行批处理吸收实验，并且可以利用吸附等温线数据确定参数。该方法的问题将是获得足够量的纯的分离的变体，因为一些变体可以少量存在并与其他变体合并。

图3：离子交换层析法电荷变体分离的建模。A图显示了通过高效液相色谱分析重建的峰，B图显示了典型的仿真图。A1和A2是酸性变体；B1是基本的变体蛋白质样品。

步骤4：模型验证
可以通过使用与商业层析柱相同床高的实验室规模的层析柱，并在各种蛋白质负载下运行该层析柱，以涵盖可能的操作范围，从而进行模型验证。洗脱梯度也应在一定的范围内进行测试。在非常低的梯度或非常低的条件变化时，该模型可能无法提供准确预测，因为在极端离子浓度下扩散系数可能不是恒定的。

步骤5：过程优化
一旦建立了模型和模型参数，就可以进行过程参数优化研究。下表2：具有扩展的Langmuir等温线的模型参数的典型值。τ是上图2所示的四个连续搅反应器（CSTR），可实现最佳的选择性和产率。下表2中列出了通过反演方法校准的模型参数的典型值，以供参考。图2还显示了变体的重构峰形及其拟合峰。拟合显示出与实验数据极好的一致性。主要成分洗脱的预测比较小变体的预测更准确。总残留误差小于0.01。

图2：具有扩展的Langmuir等温线的模型参数的典型值。τs是四个连续搅反应器（CSTR），如上图2所示。

机械模型在生物技术行业中的使用
从上述案例研究中可以看出，使用确定模型参数的方法，可以高精度地完成复杂的四组件系统的预测。由于有效的数值方法的可用性，该方法对于当前模型是可行的。即使是详细的一般模型，典型的仿真也可以在5分钟以内完成（在Intel i7台式机上）。通过仿真，可以直接从过程层析图中估算出参数。大多数较旧的方法很乏味，并且在很大程度上取决于批次数据。较旧的方法，再加上效率相对较低的数值方法，被认为过于耗费资源和时间，无法在工业环境中使用。

结论
需要有新的发展来了解极限负载能力下的吸附行为。层析树脂的结构和化学性质将继续发展，并且在过去十年中取得了许多进步，这些进步使得利用机械模型来实现高效制造成为可能。

机械建模还可用于执行敏感性分析，以评估各种输入过程变量对输出的影响。建模可以提高工艺过程一致性研究的效率，帮助进行过程监视，并可以促进过程分析技术（PAT）的实施。随着生物技术行业试图将QbD和PAT的原则制度化并朝着连续处理的方向发展，该行业将在未来十年内看到建模的兴起。

文章来源：
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