具有PMBL基因表达特征的DLBCL

原发性纵隔大B细胞淋巴瘤（PMBL）通常发生在年轻人群中，以前纵隔肿块为特征。临床上发现，部分非纵隔部位发生的淋巴瘤也具有PMBL的基因表达特征；关于这些肿瘤如何分型尚无定论。发表在《血液学》（Blood）上的一篇题为Characterization of DLBCL with a PMBL gene expression signature的研究对这类非纵隔部位的“PMBL”进行了调查，定义了一类具有独特表型和遗传特征的弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）。

一、研究背景

侵袭性B细胞淋巴瘤占全球初诊B细胞非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma，NHL）病例的40%以上，而弥漫大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）是其中最常见的一种。DLBCL的异质性提示，更精准的预后预测或潜在靶向治疗标志物或将更有助于其分子亚型分组和临床诊疗。

相较而言，原发性纵隔大B细胞淋巴瘤（Primary mediastinal large B-cell lymphoma，PMBL）则是一种相对罕见的亚型，仅占B细胞NHL的2%~3%。PMBL通常发生在年轻人群，在女性中频率更高，以前纵隔肿块的发生为病理特征。根据其解剖位置和免疫表型特征，PMBL被认为来源于胸腺髓质B细胞。虽然其形态学特征多让人联想到DLBCL，但基因表达谱分析显示PMBL与经典霍奇金淋巴瘤（classic Hodgkin lymphoma，cHL）更接近。近期的研究进一步证实了其与cHL的联系，这些研究显示PMBL存在很多与DLBCL不同但与cHL相似的分子表型，比如异常的免疫反应、JAK-STAT和NF-kB信号转导等。

自2001年以来，PMBL在WHO分类中被确认为一种独特的淋巴瘤，但在大多数情况下，其诊断仍基于临床病理共识。特别是在缺乏组织学特征的情况下，难以将PMBL与其他类型的B细胞NHL区分开来，因此很难做出明确的诊断。基因表达图谱已被证实能够准确区分PMBL和DLBCL，但基于诊断基因表达的检测尚未进入常规临床实践。

此外，临床上已经发现，部分非纵隔部位发生的淋巴瘤也具有PMBL的基因表达特征；关于这些肿瘤应该如何分类，学界也存在很大的争议。这些肿瘤最初被诊断为DLBCL，没有纵隔受累的证据，但表现出PMBL样特征；然而，与前纵隔累及的PMBL相比，它们涉及的CIITA和PD-L1/PD-L2突变明显更少。另外相对而言，没有明显纵隔累及的“PMBL”肿瘤患者人群年龄更偏大，与纵隔PMBL患者相比性别分布也更平等，但这些差异没有达到统计学意义，可能是由于既往研究的样本量较低。

因此，“非纵隔PMBL”是否确实是PMBL，或者是否代表DLBCL的一种独特亚型，仍然是一个悬而未决的问题。这一研究对这一问题展开了调查。

二、研究方法

研究者分析了325例经R-CHOP治疗的DLBCL新生肿瘤的突变和临床特征，所有DLBCL病例均进行了针对MYC、BCL2和BCL6基因的荧光原位杂交（FISH）、RNAseq、OncoSNP拷贝数检测以及靶向捕获测序结果。该研究对全部样本进行了DLBCL90 NanoString分型检测，以识别具有PMBL基因表达特征的肿瘤。在组织微阵列基础上进行免疫组化，以鉴定细胞形态学特征。通过全外显子组测序和WES分析对肿瘤突变型进一步过滤，去除潜在的种系单核苷酸。Western blot、定量逆转录PCR、流式细胞术等试验方法用于检测相关基因的RNA及蛋白质表达水平。

三、研究结果

1. 既具备PMBL基因表达特征又具备DLBCL形态学特征的肿瘤

通过NanoString对325例经R-CHOP治疗的初发DLBCL患者进行了诊断活检样本的检测，结果发现有19例肿瘤（5.8%）存在PMBL的基因表达特征（PMBLsig-pos）。这一比例也得到了既往研究中RNAseq分析的支持。其余肿瘤分为存在DHIT基因表达特征的DLBCL（DHITsig-pos）（66例，20.3%），GCB-DLBCL（110例，33.8%），未分类DLBCL（32例，9.8%）或ABC-DLBCL（98例，30.2%）。

2. 非纵隔B细胞NHL的临床特征与PMBL的基因表达特征（nm-PMBLsig-pos）

由病理学家、放射学家和肿瘤学家组成的专家小组对19个表达PMBL基因表达特征的肿瘤进行了重新评估。其中，有3例的临床病理特征被认为与PMBL的诊断相一致；这些病例随后被排除在进一步分析之外。

剩下的16例肿瘤病理学特征并没有显示纵隔被累及，但呈现出PMBL的基因表达特征。研究将其与其他DLBCL队列和最近新定义的bf-PMBL（bona fide PMBL）队列也进行了比较，发现从临床的角度来看，nm-PMBLsig-pos肿瘤患者非常类似于DLBCL。与bf-PMBL人群相比，nm-PMBLsig-pos人群通常患病年龄更大（初诊中位年龄：66年vs. 33年，P< 0.001），也较少出现血清LDH或B细胞水平升高症状（44% vs. 78%，P=0.006；19% vs. 81%，P <0.001），抑或是胸膜积液和/或心包积液（6% vs. 30%，P=0.045；0% vs. 36%，P <0.001）。

值得注意的是，在3例nm-PMBLsig-pos病例中观察到了骨髓受累，这在bf- PMBL患者中则非常罕见（19% vs. 0%，P<0.001）。

基因表达方面，MYC、BCL2和BCL6易位分别在4例（25%）、5例（33%）和2例（13%）PMBLsig-pos肿瘤中发现。有3例PMBLsig-pos肿瘤被鉴定为高级别B细胞淋巴瘤，同时伴有MYC和BCL2和/或BCL6重排（HGBL-DH/TH）。所有PMBLsig-pos肿瘤均为EBV阴性，且没有发现影响CIITA的结构重排。

3. nm-PMBLsig-pos肿瘤和bf-PMBL具有共同的免疫表型

所有PMBLsig-pos肿瘤的免疫组化染色（H&E法）形态特征相似，胞浆丰富，与典型的PMBCL肿瘤细胞形态类似。大多数nm-PMBLsig-pos肿瘤的PMBL标记物CD23（71%）和MAL（57%）分别呈阳性，而在其他的DLBCL队列中，这些蛋白的表达罕见或缺失。

有4例nm-PMBLsig-pos肿瘤（25%）表现为PD-L1和/或PD-L2阳性，而在其他DLBCL队列中PD-L1和/或PD-L2阳性的肿瘤数量则为12例（4%，P< 0.001）。其他DLBCL样本有35%存在FAS染色缺失，nm-PMBLsig-pos组则一例都没有（P=0.02）。这说明相较而言，PD-L1/2和FAS在PMBLsig-pos肿瘤中会特异性富集。

4. nm-PMBLsig-pos与bf-PMBL有突变分子共性，但免疫逃避模式不同

15例nm-PMBLsig-pos肿瘤进行的全外显子组测序显示，其与bf-PMBLs样本的突变模式存在一定的相似性。比如参与JAK-STAT信号通路的蛋白编码基因，包括SOCS1、DUSP2、IL4R和STAT6，以及编码E3泛素连接酶、参与NFkB信号的BIRC3基因，都在nm-PMBLsig-pos存在富集的突变。

另外，分别在nm-PMBLsig-pos肿瘤和bf-PMBL中发现的BIRC3和NFKBIE多重突变表明，虽然NF-B信号干扰在两种肿瘤中都很常见，但这种干扰通常通过不同的机制建立。类似地，两种肿瘤中都存在影响免疫反应的突变，但在nm-PMBLsig-pos肿瘤中这些突变主要来自CD83基因，在bf-PMBL肿瘤中则主要来自B2M和CIITA。特定基因差异表明了二者存在不同的免疫逃避机制。

5. nm-PMBLsig-pos肿瘤和B细胞来源（GCB）DLBCL存在IL4R信号相关差异

突变分析表明，nm-PMBLsig-pos和GCB-DLBCL之间的IL4R突变模式和功能有显著的不同。nm-PMBLsig-pos肿瘤中的一些常见的突变基因，包括JAK-STAT信号相关基因以及CD83等，在GCB-DLBCL中突变程度都较低或缺失。

靶向测序结果分析显示，与GCB-DLBCL相比，IL4R突变在nm-PMBLsig-pos肿瘤中不仅突变更为频繁，还存在不同的突变模式。IL4R在nm-PMBLsig-pos样本中，表现出大量胞外结构域的突变，而胞质突变较少；GCB-DLBCL并非如此。既往研究显示，影响IL4R胞外结构域的突变具有构成性激活下游JAK-STAT通路的能力，而影响IL4R细胞质结构域的突变则不会导致JAK-STAT通路的激活。

6. nm-PMBLsig-pos肿瘤的其他突变特征

在nm-PMBLsig-pos肿瘤中，一些基因突变显示出异常体细胞高突变的模式，尤其是AID介导的异常体细胞高突变（aSHM），相关靶基因SOCS1、CD83、BCL7A、MYC、SGK1和PIM1均在nm-PMBLsig-pos类型中存在高频突变。

另外，尽管nm-PMBLsig-pos肿瘤的生发中心大多为B细胞来源，与GCB-DLBCL相比，其更常见9p24的扩增，这一点则与bf-PMBL更相似。在nm-PMBLsig-pos肿瘤中，9p24扩增与JAK2、CD274和PDCD1LG2转录水平的增加相关，故而其上调JAK-STAT通路的机制也可能与此相关。

在nm-PMBLsig-pos肿瘤中还观察到了比GCB-DLBCL更频繁的免疫调节基因CD70的缺失（33% vs. 10%，P=0.02），在bf-PMBL中则并未观察到这一点。较之GCB-DLBCL，nm-PMBLsig-pos肿瘤的REV1水平也更低。部分GCB-DLBCL中观察到RB1（13q14.2）和PTEN（10q23.31）转录水平的缺失与表达下降，但在nm-PMBLsig-pos样本中则没有观察到这一现象。

四、研究总结

本研究定义了一种特殊类型的侵袭性B细胞淋巴瘤，其具有PMBL基因表达特征，但临床特征与DLBCL更加类似。通过对325例初诊DLBCL病例的分析，研究者从无前纵隔累及证据的患者中鉴定出存在PMBL基因表达特征的肿瘤，并定义为nm-PMBLsig-pos淋巴瘤。

基因组分析显示，这些肿瘤中的大多数表达MAL和CD23蛋白，这与在bf-PMBL中观察到的表达类似。临床特征评估显示，nm-PMBLsigpos与DLBCL密切相关，大多数病例显示生发中心B细胞样细胞起源。与bf-PMBLsig-pos相比，nm-PMBLsig-pos患者通常年龄较大，未表现出胸膜累及。值得注意的是，有3例nm-PMBLsig-pos患者观察到骨/骨髓受累。

尽管在临床特征上与bf-PMBL不同，但nm-PMBLsig-pos肿瘤在分子水平上与bf-PMBL相似，具有免疫反应、JAK-STAT和NF-kB信号的上调。突变分析显示，nm-PMBLsig-pos肿瘤中，SOCS1、IL4R、ITPKB和STAT6基因，以及CD83和BIRC3体细胞基因频繁发生突变，且后两者的突变频率显著高于在GCB-DLBCL和bf-PMBL分型中的水平。

研究最终将nm-PMBLsig-pos淋巴瘤作为一类别具有独特表型和遗传特征的DLBCL，这对侵袭性B细胞淋巴瘤的基因表达、基于突变的亚型分类，以及相关的靶向治疗都具有潜在的意义。拷贝数分析显示，nm-PMBLsig-pos肿瘤中存在丰富的突变，这可能为这一DLBCL亚群提供潜在的新治疗途径；例如，显示9p24增益的nm-PMBLsigpos肿瘤患者可能受益于针对PD-1/PD-L1的免疫治疗。另外，该研究提供了一种便捷可行的检测方法，nm-PMBLsig-pos可以通过DLBCL90 Nanostring分析识别，这对分型和诊断程序具有潜在的影响，也进一步强调了基因表达分析在DLBCL亚型中的价值。

总而言之，共同的基因表达模式是该研究的基础，它很可能代表了异质体细胞突变的总和，而这些突变汇聚在共同的途径上时，能够体现出各类型PMBL共享的特征。

五、参考文献

Duns G, Viganò E, Ennishi D, Sarkozy C, Hung SS, Chavez E, Takata K, Rushton C, Jiang A, Ben-Neriah S, Woolcock BW, Slack GW, Hsi ED, Craig JW, Hilton LK, Shah SP, Farinha P, Mottok A, Gascoyne RD, Morin RD, Savage KJ, Scott DW, Steidl C. Characterization of DLBCL with a PMBL gene expression signature. Blood. 2021 Jul 15;138（2）:136-148. doi: 10.1182/blood.2020007683. PMID: 33684939.