亚当斯-奥利弗综合征 3 免疫球蛋白 KAPPA J 区域重组信号结合蛋白

抗原识别特异性的巨大多样性主要是由免疫球蛋白和 T 细胞受体基因中称为变量（V）、多样性（D） 和连接（J） 的多个种系 DNA 片段的体细胞组合组装产生的。V、D 和 J 的每个片段的侧翼是一个重组识别序列（RS），该序列由一个回文七核苷酸序列和一个由 12 或 23 bp 间隔序列隔开的富含 AT 的非命名序列组成。七聚体和九聚体序列在进化过程中高度保守，而间隔序列则不是。几条证据表明，V（D）J 重组过程是由 RS 的识别指导的。参与 V（D）J 重组的基因包括 RAG1（ 179615 ） 和 RAG2（ 179616） 在小鼠中。Igkjrb 蛋白在小鼠前 B 细胞系的核提取物中被鉴定为 Jk 型 RS 特异性结合蛋白，也可能参与其中。IGKJRB 基因在人类、小鼠、非洲爪蟾和果蝇等许多物种中非常保守。Amakawa 等人使用小鼠 Igkjrb 的 cDNA 片段（1993）分离出它的人类对应物 IGKJRB。分离出三种具有不同 5-prime 序列的 cDNA，表明存在 3 种蛋白质同种型。其中两个可能是人类细胞特有的，因为未检测到小鼠对应物。人和小鼠基因的氨基酸序列在外显子 2 到 11 中的相同性为 98%，而人和小鼠外显子 1 序列的同源性为 75%。果蝇中同源基因参与周围神经系统发育的事实表明 RBP-Jk 蛋白可能具有更广泛的作用。

▼ 测绘

Gross（2011）基于 RBPJ 序列（GenBank AK302230 ） 与基因组序列（GRCh37） 的比对，将 RBPJ 基因对应到染色体 4p15.2。

假基因

通过荧光原位杂交（FISH），Amakawa 等人（1993）证明功能性 IGKJRB 基因位于 3q25，2 个假基因位于 9p13 和 9q13（位于 9 号染色体不同臂上的 2 个假基因与 3 个 IGKJRB 蛋白中的 1 个的 cDNA 显示出 91% 的同源性。加工后的假基因彼此不同。Amakawa等人（1993）为它们的产生提出了以下进化机制：原始假基因从 mRNA 进化而来，该 mRNA 被整合到染色体 9p13 的一个区域中。下一个过程可能是最近发生的事件，包括原始假基因的复制、涉及 9p13 和 9q13 的染色体倒位，以及随后由点突变、核苷酸插入和缺失引起的分歧。通过Southern印迹分析检查外周淋巴细胞表明，22个个体中有8个的基因组缺乏位于9q13的假基因2。）通过FISH，Tang等人（1997）未能在 3q25 上找到功能基因的位点，而是发现功能基因定位于 9p13-p12 和 9q13，这是Amakawa 等人先前指定假基因的 2 个位点（1993）.

▼ 基因功能

汉高等人（1994）确定 CBF1 与 IGKJRB1 相同。克里斯滕森等人（1996）发现蠕虫 Lag1 基因的产物，如 CBF1 和果蝇同源物“无毛抑制因子”，特异性结合共有 DNA 序列 RTGGGAA（另见Tun 等人（1994））。这个介导转录激活或抑制的 DNA 结合因子家族被称为 CSL。

RBPJ 在 Notch 信号的下游立即起作用（见190198）。韩等人（2002）使用条件基因敲除策略来灭活小鼠骨髓中 Rbpj 的 DNA 结合域，并发现 Rbpj 是 T 细胞发育所必需的。在没有 Rbpj 的情况下，胸腺 B 细胞发育增加。韩等人（2002）提出 RBPJ 通过介导 Notch 信号传导控制淋巴祖细胞中 T 细胞与 B 细胞的命运决定。

根据 CD4（ 186940 ） 和 CD8（参见186910 ） 的表达，胸腺细胞可分为 4 个亚群，其中双阴性（DN） 细胞最不成熟。DN 种群可进一步细分为 DN1 到 DN4 4 个子集。谷垣等人（2004）使用条件性敲除策略在小鼠的 DN2 和 DN4 阶段使 Rbpj 失活。DN2 的失活导致 α-β T 细胞在 DN3 阶段严重发育停滞，并增强了 γ-δ T 细胞的生成。DN4 的失活导致 CD4/CD8 谱系定型没有异常，但它导致 Th1 反应增强和 T 细胞增殖减少。谷垣等人（2004）得出的结论是，Notch/RBPJ 信号传导不仅调节 T 细胞发育过程，而且通过调节外周 T 细胞来调节免疫反应的方向和幅度。

范埃斯等人（2005）显示在条件性去除常见的 Notch 通路转录因子 CSL/RBP-J 后，增殖性隐窝细胞迅速大量转化为有丝分裂后杯状细胞。作者通过用 γ-分泌酶抑制剂阻断 Notch 级联反应获得了类似的表型。该抑制剂还在携带 Apc 肿瘤抑制基因（ 611731 ） 突变的小鼠的腺瘤中诱导杯状细胞分化。因此，维持隐窝和腺瘤中未分化的增殖细胞需要 Notch 和 Wnt 级联的协同激活。

Siekmann 和 Lawson（2007）证明 Notch 信号传导对于限制血管生成细胞行为以在斑马鱼胚胎发育节段性动脉中提示细胞是必要的。在没有 Notch 信号成分 Rbpsuh、Siekmann 和 Lawson（2007）的情况下观察到节段性动脉过度发芽，而 Notch 激活抑制血管生成。通过镶嵌分析，他们发现缺乏 Rbpsuh 的细胞在发芽过程中优先定位于末端位置。相反，Notch信号已被激活的细胞被排除在尖端细胞位置之外。体内延时分析表明，内皮尖端细胞在发芽过程中经历了典型的增殖和迁移模式。在没有 Notch 的情况下，几乎所有发芽的内皮细胞都表现出尖端细胞行为，导致节段动脉内的细胞数量过多。此外，Siekmann 和 Lawson（2007）发现 Flt4（ 136352）在节段动脉尖端细胞中表达，并在没有缺口的情况下在整个芽中异位表达。Flt4 的缺失可以部分恢复 Rbpsuh 缺陷节段动脉中的正常内皮细胞数量。最后，Notch 配体 Dll4（ 605185 ） 的缺失也导致节段动脉内内皮细胞数量增加。Siekmann 和 Lawson（2007）得出结论，他们的研究综合起来表明，正常血管生成需要对发育中的血管芽中的细胞身份、位置和行为进行适当的规范，并在此过程中涉及 Notch 信号通路。

PTF1A（ 607194 ） 是胰腺发育所需的基本螺旋-环-螺旋转录因子。增井等人（2007）发现在小鼠早期胰腺发育过程中，Ptf1a 在稳定的三聚体 DNA 结合复合物（PTF1） 中与 Rbpj 相互作用。随着腺泡细胞发育的开始，Rbpj 被替换为 Rbpjl，即组成型活性、胰腺限制的 Rbpj 旁系同源物，并且 Rbpjl 是 PTF1 复合物的直接目标。在腺泡细胞发育开始时，当第一次诱导 Rbpjl 基因时，含有 Rbpj 的 PTF1 复合物与 Rbpjl 启动子结合。随着发育的进行，Rbpjl 逐渐取代与 Rbpjl 启动子结合的 PTF1 复合物中的 Rbpj，并出现在其他腺泡特异性基因（包括分泌性消化酶基因）的启动子上的 PTF1 复合物结合位点上。引入无法结合 Rbpj 的 Ptf1a 突变体会​​在未成熟阶段截断胰腺发育，而不会形成腺泡或胰岛。

水谷等人（2007）表明神经干细胞和中间神经祖细胞都对 Notch 受体激活有反应，但神经干细胞通过典型的 Notch 效应器 CBF1 发出信号，而中间神经祖细胞减弱了 CBF1 信号。此外，虽然 CBF1 的敲低促进了神经干细胞向中间神经祖细胞的转化，但 CBF1 的激活不足以将中间神经祖细胞转化回神经干细胞。Mizutani 等人同时使用转基因和瞬时体内报告基因分析（2007）表明神经干细胞和中间神经祖细胞在小鼠的端脑心室区共存，并且可以根据 CBF1 活性前瞻性地分离它们。此外，通过体内移植，他们发现虽然神经干细胞以相似的频率产生神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，但中间神经祖细胞主要是神经源性的。水谷等人（2007）得出的结论是，他们的研究以及之前关于造血干细胞的研究表明，使用或阻断 Notch 下游的 CBF1 级联反应是区分干细胞与各种组织中更有限的祖细胞的一般特征。

Notch 信号在发育和成人组织更新过程中调节基因表达，以规范不同组织中的细胞命运。响应于配体结合，Notch 的细胞内结构域（ICD） 被 γ-分泌酶复合物（见104311）蛋白水解释放并转移到细胞核，在那里它与 CSL 结合并触发其从阻遏物转化为 Notch 靶标的激活物基因表达。恩格尔等人（2010 年）发现 Mtg16（CBFA2T3；603870）-/- 小鼠造血祖细胞在响应 Notch 信号时，除了分化受损外，还表现出 Notch 靶标的表达升高。通过恢复 Mtg16 表达来逆转该缺陷。Engel 等人使用小鼠和人类细胞（2010）表明所有 MTG 家族蛋白与 CSL 结合，MTG16 与所有 Notch 受体蛋白的 ICD 结合。MTG16 与 Notch ICD 的结合破坏了 MTG16-CSL 和 MTG16-NCOR（参见600849）相互作用并允许 Notch 信号传导。突变和共沉淀分析显示 MTG16 的 N 末端 PST 区域直接与 Notch ICD 相互作用，并且该结合孤立于 DNA、CSL 和组蛋白脱乙酰酶结合所需的 MTG16 NTR 结构域。Mtg16 的 PST 区域对于小鼠造血祖细胞中 Mtg16 依赖性谱系规范也是必不可少的。恩格尔等人（2010）得出结论，MTG16 是 Notch 信号传导的一个组成部分，有助于对典型 Notch 靶基因进行基础抑制。

童等人（2011）发现人类 BOAT1（ATXN1L; 614301 ） 在果蝇机翼中的表达破坏了 Notch 信号，导致机翼缺陷。HEK293 细胞的免疫共沉淀分析表明，BOAT1 和 ATXN1（ 601556 ） 均会沉淀 CBF1，它在与 NICD 相关时可作为转录激活因子。蛋白质下拉和酵母 2 杂交分析证实了相互作用，并表明 BOAT1 和 ATXN1 竞争 CBF1 结合。共免疫沉淀实验表明 NICD 破坏了 CBF1-BOAT/ATXN1 相互作用。报告基因检测显示，BOAT1 和 ATXN1 均抑制 HEY1 启动子处的 CBF1 活性（ 602953），Notch 靶基因。染色质免疫沉淀分析表明，Boat1 和 Atxn1，除了 Smrt（NCOR2; 600848 ），在分化小鼠 C2C12 成肌细胞时占据了 Hey1 启动子。Atxn1 与 Hey1 启动子短暂结合，而在相同条件下，Boat1 和 Smrt 仍与 Hey1 启动子结合。童等人（2011）得出结论，BOAT1 和 ATXN1 是染色质结合因子，在没有 NCID 的情况下通过充当 CBF1 辅助抑制因子来抑制 Notch 信号传导。

COX4I2 基因（ 607976 ） 包含一个保守的氧反应元件（ORE），它在 4% 的氧浓度下具有最大活性。Aras 等人使用酵母 1-杂交筛选来鉴定与人类 COX4I2 的 13-bp ORE 结合的转录因子，然后进行 DNA 结合测定（2013）检测到CHCHD2（ 616244 ） 、CXXC5（ 612752 ） 和 RBPJ 的结合，而不是 HIF1A（ 603348 ） 的结合。荧光素酶分析表明，RBPJ 和 CHCHD2 作为 ORE 的激活剂起作用，而 CXXC5 则抑制它。共免疫沉淀分析表明，RBPJ 与 CHCHD2 和 CXXC5 相互作用。用 Chchd2 或 Rbpj 的小干扰 RNA 处理大鼠原代肺细胞导致 Cox4i2 表达显着降低。

通过免疫组织化学分析，Kulic 等人（2015）观察到人类乳腺肿瘤中 RBPJ 的频繁消耗，证实了微阵列数据。在 RBPJ 耗尽后将人类肿瘤细胞植入免疫缺陷小鼠会导致肿瘤生长增强。敲除 RBPJ 导致 NOTCH 靶基因显着上调，例如 HEY1、HES1（ 139605 ）、SNAIL1（SNAI1; 604238 ） 和 GUCY1A3（ 139396 ） 以及 MMP1（ 120353 ）），表明 RBPJ 缺乏会导致类似于 NOTCH 的基因特征，RBPJ 会激活一部分 NOTCH 靶基因。如 EMSA、染色质免疫沉淀和实时定量 PCR 所示，RBPJ 消耗导致与启动子活性相对应的表观遗传变化。功能研究表明，RBPJ 缺乏可能通过激活 MYC（ 190080 ） 和 NFKB（参见164011 ） 来增加肿瘤细胞的存活率。库利奇等人（2015）得出结论，RBPJ 的缺失会抑制靶基因启动子，从而允许通过促进肿瘤发生的替代转录因子进行 NOTCH 非依赖性激活。

通过酵母 2 杂交、共免疫沉淀和下拉分析，Xu 等人（2017）发现人类 L3MBTL3（ 618844 ） 直接与 RBPJ 相互作用。突变分析表明，这种相互作用需要 L3MBTL3 的 N 末端区域和 RBPJ 的β-三叶结构域（BTD）。Notch ICD 还与 RBPJ 的 BTD 相互作用，允许 L3MBTL3 和 Notch ICD 竞争 RBPJ 结合。热力学分析表明，Notch ICD 在与 RBPJ 结合方面可以胜过 L3MBTL3。然而，在没有 Notch 信号的情况下，与 L3MBTL3 的相互作用允许 RBPJ 在染色质上募集 L3MBTL3 以抑制 Notch 靶基因的表达。L3MBTL3 也与 KDM1A（ 609132），一种组蛋白去甲基化酶，并将 KDM1A 与 Notch 响应元件联系起来。KDM1A 与 RBPJ 相互作用并促进组蛋白 H3 的二甲基化 lys4 的去甲基化（参见602810），从而抑制 Notch 靶基因的表达。果蝇和秀丽隐杆线虫的遗传分析表明，RBPJ-L3MBTL3 相互作用在后生动物中是进化保守的。

▼ 分子遗传学

Hassed 等人使用变体过滤策略在 2 个患有 Adams-Oliver 综合征（AOS3; 614814 ）的不相关家族中进行外显子组重测序（2012 年）在 RBPJ 基因（147183.0001和147183.0002）中发现了 2 个不同的杂合错义突变，这些突变与每个家族的疾病分离。功能分析证实突变 RBPJ 的 DNA 结合受损。

▼ 基因结构

天川等人（1993）证明功能性 IGKJRB 基因包含 13 个外显子并且跨越至少 67 kb。人类基因组包含 1 个功能性 IGKJRB 基因和 2 种加工假基因。

▼ 动物模型

RBPSUH 和 DLL4（ 605185 ） 都参与 Notch 信号传导。克雷布斯等人（2004）表明，小鼠中的 Dll4 单倍体不足或 Rbpsuh 敲除导致严重的血管缺陷，导致胚胎致死。Rbpsuh -/- 胚胎不表达几种动脉特异性内皮细胞标记。Rbpsuh 功能的条件失活表明 Notch 激活在内皮细胞谱系中是必不可少的。Dll4 和 Rbpsuh 突变胚胎也表现出动静脉畸形，可能是由于无法建立和维持不同的动静脉血管床。

王等人（2016）发现，骨折后，骨骼祖细胞中 Rbpjk 条件性缺失的小鼠沿骨膜持续形成愈伤组织，而皮质之间没有桥接。组织学分析和机械能力评估表明骨折修复延迟和骨折骨完全不愈合。免疫荧光显微镜显示骨髓基质/干细胞（BMSCs） 的消耗具有改变的分化潜能，而不是改变 Rbpjk 突变小鼠的血管形成或破骨细胞数量。王等人（2016）得出结论，无论稳定性和血管分布如何，骨折修复都需要 NOTCH 信号传导和 BMSC。

▼ 等位基因变体（ 2 示例）：

.0001 亚当斯-奥利弗综合症 3
RBPJ、GLU63GLY
在患有 Adams-Oliver 综合征（AOS3; 614814 ） 的父女中，Hassed 等人（2012）确定了 RBPJ 基因中 188A-G 过渡的杂合性，导致高度保守的 DNA 结合域中的 glu63 到 gly（E63G） 取代。使用与 HES1（ 139605 ）启动子中的规范 RBPJ 结合位点相对应的寡核苷酸进行功能分析表明，虽然野生型 RBPJ 与探针形成了特异性复合物，但 E63G 突变体没有表现出任何特异性结合复合物。同样，在活细胞中，与野生型 RBPJ 相比，E63G 突变体与 HES1 启动子的结合减少。

.0002 亚当斯-奥利弗综合征 3
RBPJ, LYS169GLU
在来自 3 代亚当斯-奥利弗综合征（AOS3; 614814 ） 家族的受影响个体中，Hassed 等人（2012）确定了 RBPJ 基因中 505A-G 过渡的杂合性，导致高度保守的 DNA 结合域中的 lys169 到 glu（K169E） 取代。使用与 HES1（ 139605 ）启动子中的典型 RBPJ 结合位点相对应的寡核苷酸进行功能分析表明，虽然野生型 RBPJ 与探针形成了特异性复合物，但 K169E 突变体没有表现出任何特异性结合复合物。同样，在活细胞中，与野生型 RBPJ 相比，K169E 突变体与 HES1 启动子的结合减少。