胸腺嘧啶激酶，线粒体

胸苷激酶-2（TK2） 是一种线粒体脱氧核糖核苷激酶，可磷酸化胸苷、脱氧胞苷和脱氧尿苷，以及抗病毒和抗癌核苷类似物（Johansson 和 Karlsson，1997 年）。

▼ 克隆与表达

Johansson 和 Karlsson（1997）克隆了编码人类 TK2 的 cDNA。该基因编码234个氨基酸的多肽。尽管 TK2 被认为存在于线粒体中，但它不包含线粒体易位信号序列。Northern印迹分析显示TK2普遍表达为2.4和4 kb的2个转录物。TK2 cDNA 的表达产生了 60-kD 的蛋白质。

基于人类 TK2 的部分蛋白质序列，Wang 等人（1999）分离出人脑 TK2 cDNA。王等人（1999）指出，尽管他们分离的 cDNA 对应于全长成熟蛋白，但它可能是不完整的，因为它缺少线粒体靶前序列的编码区。他们报道预测的蛋白质序列与纯化的 TK2 的序列相匹配，但与Johansson 和 Karlsson（1997）推断的 TK2 序列的 N 末端和第 28 位氨基酸不同。TK2 与脱氧胞苷激酶（ 125450 ） 和脱氧鸟苷激酶（DGUOK; 601465 ）具有约 40% 的同一性） 在氨基酸水平上。Northern印迹分析表明TK2基因表达为多个转录物，其中一些显示出组织特异性模式。在睾丸和卵巢中观察到最高水平的表达。

通过用Wang 等人报道的 TK2 cDNA 筛选人类基因组 BAC 文库（1999），其次是数据库分析，Wang 等人（2003）获得了全长 TK2 cDNA。推断的蛋白质含有 265 个氨基酸，并具有 N 端线粒体前导序列。

佐藤等人（2009）鉴定了许多 TK2 剪接变体，它们起始于外显子 8 或 9，并包括更多的上游外显子。RT-PCR 检测到 TK2 上游外显子在多种组织中的可变表达。

Gross（2009）指出，TK2 的修订序列（GenBank NP_004605.3 ） 表明全长 TK2 蛋白包含 307 个氨基酸。贝欣等人（2012）指出，TK2 序列已再次修改（GenBank NP_004605.4 ），全长 265 个氨基酸的 TK2 蛋白缺少早期序列（GenBank NP_004605.3 ） 中发现的 42 个 N 端氨基酸。

▼ 基因功能

Johansson 和 Karlsson（1997）发现 TK2 cDNA 的表达导致蛋白质具有与纯化的人 TK2 相似的磷酸化活性。

王等人（1999）对重组和天然 TK2 形式进行了表征，发现该酶具有广泛的底物特异性和复杂的动力学，表明它可能在化学治疗性核苷类似物的激活中发挥作用。

▼ 基因结构

萨达等人（2001）指出 TK2 基因包含 10 个外显子。佐藤等人（2009）确定 TK2 基因包含 16 个外显子，这些外显子受到广泛的可变剪接。

▼ 测绘

线粒体 TK2 的基因位于 16 号染色体上（Willecke 等人，1977 年）。Johansson 和 Karlsson（1997）在 TK2 cDNA 中发现了 2 个 STS 标记，它们对应到染色体 16q22。TK2 基因与染色体 16q22.1 上的 BEAN 基因（ 612051 ） 部分重叠，并以相反的方向转录（ Sato et al., 2009 ）。

▼ 分子遗传学

常染色体隐性线粒体 DNA 耗竭综合征 2

Saada 等人 在 4 名患有常染色体隐性遗传线粒体 DNA 耗竭综合征-2（MTDPS2; 609560 ） 的个体中，表现为严重肌病的婴儿期发病（2001）确定了 TK2 基因中的 2 个突变（ 188250.0001 - 188250.0002 ）。在这些个体中，肌肉线粒体中 TK2 的活性降低到健康对照个体平均值的 14% 至 45%。曼德尔等人（2001）鉴定了另一种 mtDNA 耗竭综合征形式的 DGUOK 基因突变，即肝脑型（MTDPS3; 251880）。他们指出，用于 ​​mtDNA 合成的脱氧核苷三磷酸（dNTPs） 的主要供应来自 DGUOK 和 TK2 启动的补救途径。mtDNA 耗竭与编码这两种激酶的基因突变的关联表明，补救途径酶参与了维持平衡的线粒体 dNTP 池。

贝欣等人（2012 年）在 3 名具有缓慢进展形式的MTDPS2的无关成人患者中发现了纯合或复合杂合 TK2 突变（188250.0003、188250.0005和188250.0006） 。所有患者都报告了某种形式的肌张力减退、早期疲劳或儿童早期行走延迟，其中 2 名儿童在儿童期出现近端肌肉无力。尽管肌肉活检显示 mtDNA 缺失，但与患有更严重疾病形式的患者（约 11% 的对照组）相比，残留的 mtDNA（约 30% 的对照组）更高。然而，没有明显的基因型/表型相关性。

伴有线粒体 DNA 缺失的常染色体隐性进行性外眼肌麻痹 3

通过外显子组测序，Tyynismaa 等人（2012 年）在 2 名患有成人发病的常染色体隐性进行性眼外肌麻痹伴线粒体 DNA 缺失 3（PEOB3; 617069 ） 的芬兰姐妹中发现了 TK2 基因（188250.0007和188250.0008 ）中的复合杂合错义突变。Tyynismaa 等人（2012）表明，与 MTDPS2 患者相比，突变体的较高残留活性对应于这些患者的较晚发病和较温和的表型。

▼ 动物模型

阿克曼等人（2008）创造了在 Tk2 基因中携带 his126 到 asn（H126N） 突变的小鼠。人类的直系同源突变（H163N；见188250.0001） 导致早期肌肉特异性形式的 mtDNA 耗竭综合征。以预期的孟德尔频率获得纯合突变小鼠（Tk2 -/-），出生时表现正常。然而，在出生后第 10 天，它们显示出相对于野生型和杂合突变同窝出生的一些缺陷，包括生长迟缓、自发活动减少、全身粗颤和步态受损。他们迅速发展为虚弱，在 2 周大时导致严重的压力或死亡。Tk2 -/- 动物在所分析的所有组织中都显示出 Tk2 活性降低，脑中活性降低至野生型的 1.7%，这是受影响最严重的组织。在 Tk2 -/- 小鼠中，脑线粒体的 dTTP 浓度约为野生型的 20%，而肝线粒体的 dTTP 和 dCTP 水平降低。这些组织中其他 dNTPs 的含量没有变化，其他组织中的 dNTP 水平不受影响。mtDNA 的消耗在大脑中最为突出，占野生型的 12.5%，只有大脑表现出呼吸链酶活性降低，主要是复合物 I 和 IV，以及 ATP 水平和 ATP/ADP 比率降低。脊髓神经元有异常的空泡变化，脊髓和皮质的白质显示胶质细胞活化的迹象。阿克曼等人（2008）得出结论，与在 H121N（现为 H163N）突变患者中观察到的肌肉特异性表型相反，H126N 突变纯合小鼠表现出快速进展的脑脊髓病。

巴特萨吉等人（2010）证明，小鼠体内 Tk2 活性的丧失导致严重的共济失调表型，伴随着 mtDNA 拷贝数减少和大脑中电子传递链蛋白的稳态水平降低。在 Tk2 缺陷的小脑神经元中，这些异常与线粒体生物能量功能受损、线粒体超微结构异常和所选神经元类型的退化有关。

洛佩兹-戈麦斯等人（2021）评估了在 Tk2 缺陷小鼠模型中使用和不使用嘧啶脱氧核苷（脱氧胞苷（dC）和胸苷（dT））治疗的 AAV 基因治疗的效果。AAV9 在出生后第 1 天将 TK2 cDNA（AAV9-TK2） 传递给突变小鼠，挽救了肝脏、大脑和肌肉中的 Tk2 活性，但在肾脏中没有。与未经治疗的突变小鼠相比，经治疗的突变小鼠具有延迟疾病发作和更长的寿命。当小鼠接受连续 AAV 给药、出生后第 1 天的 AAV9-TK2 剂量和第 29 天的 AAV2-TK2 剂量治疗时，肾脏中的载体诱导没有增加，大脑中每个细胞核的载体基因组减少与仅用 AAV9-TK2 治疗的小鼠相比，肌肉和肌肉。然而，与 AAV9-TK2 处理和未处理的突变小鼠相比，AAV9-TK2/AAV2-TK2 处理的小鼠的存活率显着增加。AAV9-TK2/AAV2-TK2 治疗的小鼠和 AAV9-TK2 治疗的小鼠的生长曲线、运动功能和力量相似，并且两个治疗组都没有出现头部震颤。从出生后第 21 天开始，突变小鼠也接受了连续 AAV9-TK2/AAV2-TK2 给药和口服 dC 和 dT 治疗，与突变小鼠的其他治疗组相比，其肝脏和肾脏中的生长、存活和 mtDNA 拷贝数有所改善.洛佩兹-戈麦斯等人（2021）得出结论，补充 dC 和 dT 可增强 TK2 基因治疗的效果，并支持未来对 TK2 缺乏症患者进行联合治疗的潜力。

▼ 等位基因变体（ 8个精选示例）：

.0001 线粒体 DNA 耗竭综合征 2（肌病型）
TK2、HIS121ASN
基于 TK2（GenBank NP_004605.4 ） 的修订蛋白质序列，称为 HIS90ASN（H90N） 和后来的 HIS163ASN（H163N） 的突变现在称为 HIS121ASN（H121N）（ Behin et al., 2012 ）。

Saada 等人在一名患有线粒体 DNA 耗竭综合征-2（MTDPS2; 609560 ）的德系犹太人患者中，表现为肌病（2001）在 TK2 基因的核苷酸 267-268 处发现了纯合的 GC-to-AA 替换，导致 his90-to-asn（HIS90ASN） 替换。患者在 4 岁时死亡。

王等人（2003）发现具有 H121N 突变的重组人 TK2 与野生型 TK2 相比具有相似的亚基结构。与野生型 TK2 相比，H121N 突变酶的胸苷和脱氧胞苷 Km 值正常，但 Vmax 值分别低 2 倍和 3 倍，ATP 的 Km 值显着增加，导致酶效率降低。竞争实验表明，与野生型 TK2 相比，胸苷和脱氧胞苷与 H121N 突变体的相互作用不同。

.0002 线粒体 DNA 耗竭综合征 2（肌病型）
TK2、ILE212ASN
基于 TK2（GenBank NP_004605.4 ） 的修订蛋白质序列，称为 ILE181ASN（I181N） 和后来的 ILE254ASN（I254N） 的突变现在称为 ILE212ASN（I212N）（ Behin et al., 2012 ）。

Saada 等人在 3 名患有线粒体 DNA 耗竭综合征-2（MTDPS2; 609560 ） 的穆斯林阿拉伯婴儿中，表现为肌病（2001）在 TK2 基因的 542 位核苷酸处发现了一个 T 到 A 颠换，导致 ile181 到 asn（ILE181ASN） 替换。报告时，其中两名患者在 3 岁时接受了机械通气；三分之一在 19 个月大时死亡。

王等人（2003）发现具有 I212N 突变的重组人 TK2 与野生型 TK2 相比具有相似的亚基结构。然而，与具有所有脱氧核苷的野生型 TK2 相比，I212N 突变酶的活性低于 1%。

.0003 线粒体 DNA 耗竭综合征 2（肌病型）
TK2、THR108MET
基于 TK2（GenBank NP_004605.4 ） 的修订蛋白质序列，命名为 THR77MET（T77M） 和后来的 THR150MET（T150M） 的突变现在称为 THR108MET（T108M）（ Behin et al., 2012 ）。

曼库索等人（2002）描述了 2 个患有线粒体 DNA 耗竭综合征 2（MTDPS2; 609560 ） 的同胞，他们是先前描述的 H90N 突变（ 188250.0001 ） 的复合杂合子） 和一个新的 thr77-to-met（THR77MET） 突变。先证者在 12 个月大之前是正常的，当时他经常跌倒和进行性步态障碍，导致 26 个月大时无法行走。到 2 岁时，他无法站立。他在 3 岁时开始依赖机械通气，并在 40 个月大时死亡。一位姐姐也受到了类似的影响，但进展较慢。16 个月大时，她开始频繁跌倒、四肢无力和步态异常，到 4 岁时，她不再能够行走。她有升高的血清 CK 水平和乳酸性酸中毒。

在Tritschler 等人最初描述的一个家庭中（1992 年）其中 3 名同胞患有线粒体 DNA 耗竭综合征-2，Mancuso 等人（2003）确定了 THR77MET 突变的纯合性。这些患者的肌肉活检标本中有 80% 到 90% 的线粒体 DNA 缺失，并且在 40 个月大时全部死于呼吸衰竭。突变位于蛋白质的 α-4 螺旋中的活性位点附近，这对于酶二聚化和核苷识别很重要。作者指出，外显子 5 是 TK2 突变的热点。

贝欣等人（2012）报道了 2 名 T108M 突变纯合子的无关患者，但与之前与该突变相关的病程较轻且进展较慢。一名患者自出生以来出现肌张力减退、早期行走延迟和儿童近端肌无力，而另一名患者在儿童期表现出早期疲劳；两人都在三十出头时出现更严重的损伤。特征包括蹒跚步态、远端和近端肌肉无力、轴向无力和呼吸功能不全。一名患者坐在轮椅上，另一名患者不能行走超过 15 分钟。更多可变特征包括上睑下垂、声音低沉和面部无力。认知、听力和心脏功能正常。肌电图显示肌源性模式，肌肉活检显示与线粒体肌病一致的营养不良变化，包括配合物 I、III 和 IV 的缺陷。肌肉 mtDNA 消耗很明显，mtDNA 水平约为正常对照的 30%。该报告扩展了 MTDPS2 的表型谱，包括进展慢得多的患者，这可能是由于与受影响更严重的患者相比，残留肌肉 mtDNA 的保存更好。

帕拉达斯等人（2013）报道了一名 22 岁的男性，由近亲出生，由于纯合 T108M 突变而患有 MTDPS2。他的发育正常，直到 24 个月大，当时他表现出下肢近端肌肉无力，导致步态蹒跚。20 岁时，他有鼻音和轻度近端手臂无力。在肺炎引发的呼吸骤停突然发作后，他的肌肉无力迅速恶化，不得不坐轮椅。他有严重的轴向和近端肌肉无力、面部无力但没有上睑下垂、胸肌萎缩、肩胛骨翼和踝关节挛缩。他还患有病因不明的显着男性乳房发育症。实验室研究显示血清肌酸激酶升高和血清乳酸正常。肌肉样本显示营养不良、肌内膜纤维化、线粒体形状异常、线粒体复合物 I 活性降低（正常的 35%）和多个 mtDNA 缺失（45% 残留 mtDNA）。家族史显示3岁姐姐因肌营养不良呼吸衰竭死亡，前几代有2名婴儿死亡。该报告值得注意的是显着的家族内表型异质性。未进行 T108M 变体的功能研究。

.0004 线粒体 DNA 耗竭综合征 2（肌病型）
TK2、ILE53MET
基于 TK2（GenBank NP_004605.4 ） 的修订蛋白质序列，命名为 ILE22MET（I22M） 和后来的 ILE95MET（I95M） 的突变现在称为 ILE53MET（I53M）（ Behin et al., 2012 ）。

在一个有非近亲父母的西班牙裔家庭中，Mancuso 等人（2002）发现线粒体 DNA 耗竭综合征 2（MTDPS2; 609560） 是由 TK2 基因中的 ile22-to-met（ILE22MET） 突变的纯合性引起的。兄弟姐妹受到影响。姐姐从出生的头几个月就出现严重的虚弱和张力减退，并在 2 岁时去世。她的兄弟在 15 个月大之前一直正常，当时他的腰椎前凸增加和蹒跚步态。后来涉及手臂和颈部肌肉。到 2 岁时，他已经失去了行走的能力。3 岁时，他出现严重的近端肢体无力、肌肉萎缩、反射消失和脊柱侧弯。神经传导检查结果正常，但肌电图显示慢性部分去神经支配，伴有纤颤和运动单位电位严重丧失。这些电生理结果与脊髓性肌萎缩症相符。在研究时，他还活着 4 岁。

.0005 线粒体 DNA 耗竭综合征 2（肌病型）
TK2，8-BP DUP
Behin 等人在患有缓慢进行性线粒体 DNA 耗竭综合征 2（MTDPS2; 609560 ）的成年男性中（2012）确定了 TK2 基因中 2 个突变的复合杂合性：外显子 1 中的 8-bp 重复，导致移码和提前终止（Trp4ValfsTer40），以及外显子 4 中的 268C-T 转换，导致 arg90-to -cys（R90C；188250.0006） 在对 TK2 二聚体稳定很重要的区域进行替换。每个未受影响的亲本对于其中的一个突变都是杂合的。患者成纤维细胞中的 TK2 活性是对照组的 4%。患者在 13 岁时出现轻度上睑下垂，在 15 岁时出现构音障碍，在 25 岁时出现下肢近端无力。在 31 岁时，他出现上睑下垂、上注视受限、声音减弱、轴向和四肢肌肉无力以及呼吸功能不全，尽管他仍然可以走动。实验室检查显示血清肌酸激酶轻度升高，骨骼肌活检显示线粒体缺陷伴 mtDNA 耗竭（与对照组相比，残留 mtDNA 约 30%）。

.0006 线粒体 DNA 耗竭综合征 2（肌病型）
TK2、ARG90CYS
讨论 Behin 等人的 TK2 基因中的 arg90 至 cys（R90C） 突变，该突变在患有缓慢进行性线粒体 DNA 耗竭综合征 2（MTDPS2; 609560 ）的患者中以复合杂合状态发现（2012），见188250.0005。

.0007 进行性外眼肌麻痹伴线粒体 DNA 缺失，常染色体隐性遗传 3（1 个家族）
TK2、ARG225TRP
Tyynismaa 等在 2 名患有成人发病的常染色体隐性遗传进行性外眼肌麻痹伴线粒体 DNA 缺失-3（PEOB3; 617069 ）的芬兰姐妹中（2012）确定了 TK2 基因中的复合杂合突变：c.673C-T 转换，导致 arg225 到 trp（R225W） 取代，以及 c.688A-G 转换，导致 thr230 到 ala（T230A；188250.0008） 替代。通过全外显子组测序发现并通过 Sanger 测序确认的突变，根据 dbSNP（build 130）和 1000 Genomes Project 数据库进行过滤。在 400 条芬兰对照染色体中未发现 R225W 突变，但在 400 条芬兰对照染色体中的 1 条中发现了 T230A 突变。亲本 DNA 不可用于分离分析。突变的残基虽然位于高度保守的序列块内，但它们本身并不完全保守，即使在脊椎动物中也是如此。在大肠杆菌中的体外功能表达研究表明，与野生型相比，两种突变酶的 Km 值和 Vmax 值都更高，从而导致催化效率降低（T230A 为 17-22%，R225W 为 3-4%）。从两名患者身上分离出的线粒体Tyynismaa 等人（2012）表明突变体的残留活性对应于这些患者的较晚发病和较温和的表型。

.0008 进行性外眼肌麻痹伴线粒体 DNA 缺失，常染色体隐性遗传 3（1 个家族）
TK2、THR230ALA
讨论 TK2 基因中的 thr230-to-ala（T230A） 突变，该突变在 2 名患有成人发病的常染色体隐性进行性眼外肌麻痹伴线粒体 DNA 缺失-3（PEOB3; 617069 ） 的姐妹中以复合杂合状态发现，作者 Tyynismaa等人（2012），见188250.0007。