CBP/p300-相互作用反式激活子，具有富含 GLU/ASP 的 C 端结构域，2; CITED2

黑素细胞特异性基因 1 相关基因 1；MRG1
MSG1 相关基因 1
p35SRJ

HGNC 批准的基因符号：CITED2

细胞遗传学位置：6q24.1 基因组坐标（GRCh38）：6:139,371,806-139,374,647（来自 NCBI）

▼ 克隆与表达

Shioda 等人通过使用小鼠 Msg1 cDNA（参见 300149）搜索序列数据库（1996）鉴定了编码 MRG1 C 末端区域的人内皮细胞和新生儿脑 EST。盐田等人（1997）使用基于 Shioda 等人鉴定的 MRG1 EST 的寡核苷酸，通过 5-prime RACE 分离出全长人类黑素细胞 MRG1 cDNA（1996）。预测的 213 个氨基酸的人 MRG1 蛋白包含 3 个组氨酸簇，并与 MSG1 共享 2 个保守结构域：14 个氨基酸 CR1（保守区 1）和酸性 49 个氨基酸 CR2。CR2 结构域包含 12 个天冬氨酸和谷氨酸残基，这些残基在人和小鼠 MRG1 和 MSG1 蛋白中严格保守。Northern blot分析检测正常人表皮黑色素细胞和黑色素瘤细胞中MRG1的表达；除肌肉外，在所有检查的成年小鼠组织中都发现了小鼠 Mrg1 转录本。通过蛋白质印迹分析，重组 MSG1 在哺乳动物细胞中的分子量估计为 25 kD。免疫荧光细胞化学将重组 MRG1 定位于哺乳动物细胞核。

Bhattacharya 等人通过使用 p300（EP300; 602700）的 CH1 结构域探测 HeLa 细胞表达文库（1999）获得了编码 STAT2（600556）、HIF1A（603348）和 CITED2 的可变剪接主要亚型的 cDNA。序列分析预测，270 个氨基酸的同工型与小鼠蛋白有 95% 相同，并且包含一个不寻常的、35 个残基富含丝氨酸-甘氨酸的连接（SRJ），较短的 MRG1 同工型不存在这种连接。由于 SRJ，作者将这种蛋白质异构体命名为 p35SRJ。p35SRJ 蛋白没有 DNA 结合或其他已知的蛋白基序。Northern 印迹分析揭示了 2.4 kb p35SRJ 转录物的普遍表达。蛋白质印迹和脉冲追踪分析揭示了 36 kD 蛋白的不稳定表达。免疫荧光显微镜显示与 p300 的核共定位。

▼ 基因结构

Leung 等人（1999）确定 CITED2 基因包含由 2 个小内含子分隔的 3 个外显子。MRG1 中两个内含子均被剪接，而 p35SRJ 中仅内含子 1 被剪接。CITED2 还具有一个 3 kb CpG 岛，从 -1562 延伸到 +1711，以及几个重复元件。该启动子缺少 TATA 框，但具有多个 SP1 位点和 22 个推定的 STAT 结合位点。

▼

通过 STS 数据库分析进行绘图，然后进行 FISH，Leung 等人（1999）将 CITED2 基因定位到染色体 6q23.3。他们注意到 1q22 处有较弱的第二个信号。

▼ 基因功能

Shioda 等人（1997）证明由 MRG1 和 DNA 结合结构域组成的融合蛋白可激活哺乳动物细胞中的转录；这种激活依赖于 MRG1 的酸性 CR2 结构域。

通过免疫沉淀和突变分析，Bhattacharya 等人（1999）显示 p35SRJ 的 C 末端与 p300-CH1 和 CBP（600140）之间存在相互作用。然而，大多数 p300/CBP 不与 p35SRJ 结合，但 p35SRJ 确实与 HIF1A 有效竞争 p300-CH1 结合，并且它抑制 HIF1A 反式激活。与 HIF1A 一样，p35SRJ mRNA 和蛋白质也是由缺氧或去铁胺诱导的。启动子分析确定了 3 个共有的 HIF1 反应元件。巴塔查亚等人（1999）提出p35SRJ与p300/CBP的组成型相互作用可以作为一种安全机制来防止含有HIF1位点的启动子处的非法转录。

在缺氧条件下，HIF1-α与通用转录共激活因子CBP和p300的TAZ1结构域结合，促进CITED2和其他适应性基因的快速激活。CITED2 是一种负反馈调节因子，通过竞争与 TAZ1 的结合来减弱 HIF1 转录活性。HIF1-α 和 CITED2 均通过各自无序的反式激活结构域与 TAZ1 结合。HIF1-α 和 CITED2 反式激活结构域通过螺旋基序与 TAZ1 结合，螺旋基序位于保守的 LP（Q/E）L 序列两侧，而该序列对于负反馈调节至关重要。伯洛等人（2017）证明人类 CITED2 通过与 TAZ1 和 HIF1-α 形成瞬时三元复合物并通过其 LPEL 基序竞争共享结合位点来取代 HIF1-α，从而促进 TAZ1 的构象变化，从而增加 HIF1-α 解离率。通过变构增强 HIF1-α 的释放，CITED2 激活高度响应的负反馈回路，即使在适度的 CITED2 浓度下，也能快速有效地减弱缺氧反应。这种超敏感的调节开关完全依赖于这些本质上无序的蛋白质的独特的灵活性和结合特性，并且可能例证了细胞用于快速响应环境信号的常见策略。

▼ 分子遗传学

正如 Bamforth 等人的工作所示（2001, 2004），Cited2 缺失小鼠在子宫内死亡，表现出各种心脏畸形（Bamforth 等人（2001, 2004））。斯珀林等人（2005）使用 DHPLC、测序和基因分型技术，在 392 名先天性心脏病患者和 192 名对照个体组成的队列中筛选了 CITED2 基因。他们在先天性心脏病患者中发现了 7 个在对照中未检测到的 CITED2 核苷酸改变，其中包括 3 个导致氨基酸序列改变的突变：室间隔缺损（VSD2; 614431）患者中的 27 bp 缺失（602937.0001）以及 27 bp 插入和 6 bp 缺失（602937.0002 和 602937.000） 3）2名房间隔缺损患者（ASD8；614433）。所有 3 个突变都聚集在蛋白质富含丝氨酸/甘氨酸的连接处，迄今为止尚未指定其功能。斯珀林等人（2005）表明这些突变显着降低了 CITED2 反式抑制 HIF1A 的能力，其中一个 27 bp 缺失（602937.0001）显着降低了 TFAP2C（601602）共激活。这些结果揭示了富含丝氨酸/甘氨酸的区域在 CITED2 功能中的修饰作用。间隔缺损患者中这些突变的存在表明 CITED2 基因对人类先天性心脏病的发展具有致病影响。27 bp 缺失（602937.0001），显着减弱 TFAP2C（601602）共激活。这些结果揭示了富含丝氨酸/甘氨酸的区域在 CITED2 功能中的修饰作用。间隔缺损患者中这些突变的存在表明 CITED2 基因对人类先天性心脏病的发展具有致病影响。27 bp 缺失（602937.0001），显着减弱 TFAP2C（601602）共激活。这些结果揭示了富含丝氨酸/甘氨酸的区域在 CITED2 功能中的修饰作用。间隔缺损患者中这些突变的存在表明 CITED2 基因对人类先天性心脏病的发展具有致病影响。

▼ 动物模型

班福斯等人（2001）产生了缺乏 Cited2 的小鼠。Cited2 -/- 胚胎死于心脏畸形、肾上腺发育不全、颅神经节异常和脑外畸形。心脏缺陷包括房间隔缺损、室间隔缺损、主动脉骑跨、右心室双出口、持续动脉干和右侧主动脉弓。班福斯等人（2001）发现中脑区域细胞凋亡增加，并且在胚胎中期表达 Erbb3（190151）的神经嵴细胞显着减少。班福斯等人（2001）表明 Cited2 与转录因子 AP2 的所有亚型（TFAP2A，107580 和 TFAP2B，601601）相互作用并共同激活。Cited2 -/- 胚胎成纤维细胞中 TFAP2 亚型的反式激活存在缺陷，可通过异位表达的 Cited2 来挽救。由于某些 TFAP2 亚型对于神经嵴至关重要，神经管和心脏发育，Bamforth 等人（2001）提出，缺乏 Cited2 的小鼠胚胎发生异常至少部分是由于其作为 TFAP2 共激活剂的作用。

巴贝拉等人（2002）在 Cited2 位点中引入了无效突变。Cited2 -/- 突变体在妊娠晚期死亡，并表现出由于中脑和后脑闭合缺陷引起的心脏缺陷和外脑畸形。前脑-中脑边界处神经管闭合的启动是颅神经管闭合的重要步骤，但在 Cited2 -/- 突变体中受到损害。使用原位杂交的基因标记分析表明，Cited2 -/- 胚胎中前神经板和头部间充质的模式几乎没有受到影响或正常。然而，Cited2 是神经上皮细胞生存所必需的，它的缺失导致前脑-中脑边界周围的背侧神经外胚层和后脑受限横向区域的大量细胞凋亡。叶酸处理显着降低了 Cited2 -/- 胚胎体内和体外的脑外表型。然而，叶酸代谢评估显示 Cited2 -/- 突变体没有缺陷，并且在 Cited2 -/- 突变体的神经上皮细胞中观察到的细胞凋亡增加显然并未因补充叶酸而减少。

尹等人（2002）发现编码 Cited2 的基因被破坏会导致胚胎死亡，因为心脏和神经管的发育缺陷。Cited2 -/- 胚胎的形态学和多普勒超声心动图分析揭示了严重的心血管异常，包括肺动脉狭窄和室间隔缺损，并伴有峰值流出速度，这是人类法洛四联症的特征（187500）。Cited2 -/- 心脏中对 HIF1A 有反应的几个基因（例如 VEGF（192240）、SLC2A1（138140）和 PGK1（311800））的 mRNA 水平增加。VEGF 水平的增加非常显着，因为 Cited2 -/- 胚胎中的缺陷与 VEGF 转基因胚胎中的主要缺陷非常相似。最后，与野生型相比，来自 Cited2 -/- 胚胎的培养成纤维细胞证明，在缺氧条件下 HIF1A 反应基因的表达增强。这些观察结果表明，Cited2 的功能丧失是导致心脏和神经管发育缺陷的原因，部分原因是在 Cited2 缺失的情况下 HIF1 转录活性的调节。尹等人（2002）得出结论，Cited2是产前发育过程中不可或缺的调控基因。

克兰克等人（2003）发现 Cited2 缺失的小鼠胚胎成纤维细胞的增殖过早停止。这与生长分数减少、细胞形态衰老以及 Ink4/Arf（600160）细胞增殖抑制剂 p16（Ink4）、p19（Arf）和 p15（Ink4b）表达增加有关。Ink4a/Arf基因的删除完全挽救了Cited2缺失成纤维细胞的增殖缺陷，但它并没有挽救在Cited2缺失小鼠中观察到的胚胎畸形，这表明可能涉及其他途径。Cited2 缺失的成纤维细胞还显示出多梳基因 Bmi1（164831）和 Mel18（600346）的表达降低，这些基因充当 INK4A/ARF 和 Hox 阻遏物。与表达 Cited2 的逆转录病毒互补可增强增殖，诱导 Bmi1 和 Mel18 表达，Ink4a/Arf 表达减少。表达 Bmi1 和 Mel18 的逆转录病毒增强了 Cited2 缺失的成纤维细胞的增殖，表明它们在 Cited2 下游发挥作用。克兰克等人（2003）得出结论，CITED2 至少部分通过多梳基因 BMI1 和 MEL18 控制 INK4A/ARF 的表达和成纤维细胞增殖。

隔膜、流出道和主动脉弓畸形是人类最常见的先天性心血管缺陷，并且发生在缺乏 Cited2（TFAP2 转录共激活因子）的小鼠中。班福斯等人（2004）表明 Cited2 -/- 小鼠也出现偏侧性缺陷，包括右侧异构、心脏循环异常和脾功能不全，这些缺陷在混合遗传背景下受到抑制。Cited2 -/- 小鼠在左侧板中胚层中缺乏 Nodal 靶基因 Pitx2c、Nodal（601265）和 Ebaf（601877）的表达，这些基因是建立偏侧性和心血管发育所必需的。CITED2 和 TFAP2 在胚胎心脏的 Pitx2c 启动子处检测到，它们在瞬时转染测定中激活 Pitx2c 转录。班福斯等人。

早期双潜能哺乳动物性腺需要在短暂的时间内表达 Y 连锁基因 SRY（480000），以确保睾丸正常发育。WT1（607102）及其直接靶基因 SF1（NR5A1; 184757）在性别决定过程中以及在特定的睾丸和卵巢中发挥作用。在小鼠中，Buaas 等人（2009）表明转录辅因子Cited2与Wt1相互作用刺激肾上腺原基中Sf1的表达以确保肾上腺发育。Cited2 与 Wt1 和 Sf1 一起在性腺中发挥作用，将 Sry 的表达水平提高到有效启动睾丸发育的关键阈值。减少 Cited2 突变体性腺中 Wt1 或 Sf1 的基因剂量足以产生部分 XY 性逆转，而在含有亚等位 Sry（Pos）等位基因的突变体中则实现了完全性逆转。

小鼠体内缺乏转录因子 Cited2 会导致心脏畸形、肾上腺发育不全、神经管和胎盘缺陷，以及由于 Nodal-Pitx2c 通路破坏而导致部分渗透性心肺偏侧性缺陷。边沁等人（2010）表明，母亲的高脂肪饮食使偏侧性缺陷的外显率增加了一倍以上，并且令人惊讶的是，在 Cited2 缺陷胚胎中诱导腭裂。母亲饮食和 Cited2 缺失都会减少胚胎重量以及肾脏和胸腺体积。表达谱鉴定出 40 个胚胎转录本，包括 Pitx2，它们受到胚胎基因型与母体饮食相互作用的显着影响。高脂肪饮食使 Cited2 缺陷胚胎中的 Pitx2c 水平降低了 2 倍以上。综合起来，

▼ 等位基因变异体（3 个选定示例）：

.0001 室间隔缺损 2
CITED2、27-BP DEL、NT508
在膜周室间隔缺损（VSD2；614431）患者中，Sperling 等人（2005）鉴定了 CITED2 基因外显子 2 中 27 bp 缺失（508_534del27）的杂合性，导致 9 个氨基酸残基缺失（ser170_gly178del）。在 192 个对照中未发现该突变。对报告基因反式激活和抑制的分析表明，与野生型相比，27 bp 缺失将 TFAP2C 基因（601602）的共激活降低至野生型的 50%，并以约 60% 的效率抑制 HIF1A（603348）。

.0002 房间隔缺损 8
CITED2, 27-BP INS, NT534
对于继发孔型房间隔缺损（ASD8; 614433）患者，Sperling 等人（2005）证明了 CITED2 基因中的 27 bp 插入，导致在 gly178 和 ser179 之间插入 9 个新氨基酸。在 192 个对照中未发现该突变。在 HIF1A（603348）响应报告系统中，突变型 CITED2 仅表现出野生型约 75% 的抑制活性。

.0003 房间隔缺损 8
CITED2, 6-BP DEL, NT592
对于一名患有窦静脉型房间隔缺损（ASD8; 614433）且肺静脉异常回流至右心房的患者，Sperling 等人（2005）证明 CITED2 基因（592_597delAGCGGC）中存在 6 bp 缺失，导致 ser198 和 gly199 缺失。在 192 个对照中未发现该突变。在 HIF1A（603348）响应报告系统中，突变 CITED2 仅表现出野生型约 75% 的抑制活性。