加帽蛋白调节剂和肌球蛋白 1 连接子 2; CARMIL2

• RGD-、富含亮氨酸重复序列-、原调节蛋白结构域-和富含脯氨酸结构域的蛋白质；RLTPR

HGNC 批准的基因符号：CARMIL2

细胞遗传学位置：16q22.1 基因组坐标（GRCh38）：16:67,645,003-67,657,568（来自 NCBI）

CARMIL2 是一种胞质蛋白，对于 T 细胞中 CD28（186760） 共刺激至关重要（Roncagalli et al., 2016）。

▼ 克隆与表达

Matsuzaka 等人通过筛选银屑病皮肤中差异下调的基因，然后在人角质形成细胞 cDNA 文库上进行 5-prime 和 3-prime RACE（2004） 克隆了 CARMIL2，他们将其称为 RLTPR。推导的 1,435 个氨基酸的蛋白质包含一个 RGD 基序、一个富含亮氨酸重复序列（LRR）、一个富含亮氨酸重复序列区域内的原调节蛋白（190930） 结构域和一个富含脯氨酸区域，以及 4 个潜在的 N 连接糖基化位点，但没有明显的跨膜结构域。RLTPR cDNA 与大鼠和小鼠同源物分别具有 72% 和 63% 的同一性。作者鉴定了 RLTPR 基因的几种剪接变体，其中没有一个改变开放解读码组的相位。Northern 印迹分析在成人胸腺中检测到 4.7-kb RLTPR 转录物，在成人脾脏、外周血白细胞和结肠中表达较低。

使用定量 RT-PCR，Liang 等人（2013）发现小鼠Rltpr在成年胸腺和脾脏中高表达，在骨髓中表达较低，在脑和睾丸中无表达。进一步分析发现Rltpr主要表达于T细胞。

通过蛋白质印迹和流式细胞术分析，Wang 等人（2016） 发现 CARMIL2 基因在幼稚和记忆 CD4+ 和 CD8+ T 细胞、调节性 T 细胞、幼稚和记忆 B 细胞以及 NK 细胞中强表达，但在单核细胞中表达较差。

▼ 基因结构

Matsuzaka 等（2004） 确定 RLTPR 基因包含 39 个外显子，跨度约为 12 kb。外显子 1 包含假定的翻译起始密码子，外显子 39 包含翻译终止密码子 TGA。主要转录起始位点位于ATG密码子上游121bp处，3个次要转录起始位点位于主要转录起始位点下游49至64bp处。RLTPR 启动子区域包含 GC 框以及 TTK（604092）、IKBL（601022）、Sp1（189906） 和 GCR1 的转录因子结合位点，但没有 TATA 或 CAAT 框。

▼

通过基因组序列分析进行绘图，Matsuzaka 等人（2004） 将 RLTPR 基因定位到染色体 16q22。

▼ 基因功能

使用免疫沉淀实验，Liang 等人（2013） 表明小鼠 Rltpr 与肌节蛋白加帽蛋白组成型相关（CP；参见 601580）。

Lanier 等人使用免疫荧光分析（2015） 发现 CARMIL2 与迁移人类 HT1080 细胞前缘的动态波形蛋白（VIM; 193060） 丝共定位，将波形蛋白丝与膜上的肌节蛋白组装连接起来。CARMIL2 的 LRR 结构域对于与波形蛋白共定位是必要且充分的。对 CARMIL2 耗尽的 HT1080 细胞的检查表明，与波形蛋白的共定位和 CARMIL2 的 CP 结合能力对于板状足肌节蛋白组装、膜皱褶、巨胞饮作用和细胞极性是必需的。对缺乏 CARMIL2 的伤口愈合细胞中集体细胞迁移的进一步研究表明，CARMIL2 与波形蛋白的共定位（而不是 CP 结合）对于伤口愈合过程中的集体细胞迁移是必要的，而片状伪足和褶边是可有可无的。

Lanier 等人利用 HT1080 细胞的定位研究和突变分析（2016） 确定 CARMIL2 的 C 端一半控制着动态肌节蛋白网络组件在膜上的定位，而 N 端一半控制着波形蛋白中间丝的定位。作者鉴定了一个由碱性残基和疏水残基组成的保守 C 端膜结合结构域。对 CARMIL2 耗尽的 HT1080 细胞中与细胞极性、片状足动力​​学、皱褶和巨胞饮作用相关的表型的检查证实，CARMIL2 膜结合活性对于细胞中 CARMIL2 的所有功能都是必需的。进一步的研究表明，波形蛋白网络在功能上位于 CARMIL2 的上游，而肌节蛋白组装动力学在功能上位于 CARMIL2 的下游。

龙卡加利等人（2016） 表明，在小鼠和人类细胞中，RLTPR 充当桥接 CD28 与 CARD11（607210） 胞质接头和 NFKB（参见 164011）信号通路的支架。此外，RLTPR 对于 CD28 共刺激至关重要，这需要 RLTPR N 端非规范普莱克斯特林（PLEK; 173570） 同源结构域、富含亮氨酸结构域和富含脯氨酸区域。龙卡加利等人（2016） 提出 RLTPR 在 CD28 共刺激中起主导作用。他们发现，缺乏 RLTPR 会阻碍小鼠和人类 CD4（186940） 阳性 T 细胞分化为 Th1 和 Th17（参见 603149）命运。尽管 RLTPR 也在小鼠和人类 B 细胞中表达，但在小鼠中，它似乎在 B 细胞受体介导的信号传导和不依赖于 T 细胞的 B 细胞反应中发挥作用。

▼ 分子遗传学

免疫缺陷 58

Wang 等人对来自 3 个无关家庭（包括 2 个近亲家庭）的 6 名患有免疫缺陷 58（IMD58；618131）的患者进行了研究（2016） 鉴定了 CARMIL2 基因的纯合突变（610859.0001-610859.0003）。这些突变是通过连锁分析和全外显子组测序相结合发现的，并通过桑格测序证实，与疾病分离。有2个错义突变和1个无义突变。患者的某些 T 细胞亚型水平下降，包括 T 调节细胞、滤泡辅助 T 细胞和某些记忆 T 细胞亚群，包括 Th1 和 Th17。对患者 CD4+ T 细胞的体外研究显示，CD28 共刺激存在特定缺陷，响应 CD28 刺激的 NFKB 复合物下游激活受损，以及记忆 CD8+ T 细胞上 CD28 表达降低。对患者细胞进行的其他详细体外研究表明，幼稚 CD4+ T 细胞的增殖受损，某些 T 辅助细胞亚群的成熟和分化受损，以及记忆 B 细胞减少，以及 B 细胞响应 B 细胞受体（BCR） 刺激而下游 NFKB 激活受损。研究结果表明，CARMIL2 缺陷会导致 T 细胞和 B 细胞的内在缺陷。

Sorte 等人在来自 3 个不相关的挪威家庭的 4 名 IMD58 患者中（2016） 在 CARMIL2 基因中发现了相同的纯合错义突变（L639H; 610859.0004）。这种突变是通过外显子组测序发现的，并通过桑格测序证实，在所有具有可用 DNA 的家族中都与该疾病分离。在排除与相似表型相关的候选基因突变后进行外显子组测序。单倍型分析表明存在创始人效应。没有进行变体的功能研究和患者细胞的研究，但 Sorte 等人（2016） 指出，突变发生在疏水核心区域，可能会破坏 3 维结构的稳定性并破坏蛋白质功能。

Schober 等人在 4 名来自 2 个不相关的近亲家庭（分别有也门血统和巴西血统）的 IMD58 患者中（2017） 鉴定了 CARMIL2 基因的纯合突变（610859.0005 和 610859.0006）。一种突变是移码，另一种是剪接位点突变；预计两者都会导致提前终止。这些突变是通过纯合性作图和全外显子组测序相结合发现的，并通过桑格测序证实，与家族中的疾病分开。两个家族的患者淋巴细胞都显示出 CARMIL2 蛋白的缺失，这与功能完全丧失一致。患者 T 细胞的体外功能表达研究表明，CARMIL2 的缺失与初始 T 细胞活化、增殖和效应功能受损有关。以及与对照组相比，T 细胞记忆增益不足。NK 和 CD8+ T 细胞中存在脱粒和 NKG2D（KLRK1; 611817） 表达缺陷，但可以用 IL2 来挽救（147680）。与对照组相比，患者细胞表现出 CD28 介导的共信号传导受损，下游经典 NFKB 通路激活减少，以及对 EBV 反应的增殖和细胞因子产生减少。患者细胞还表现出与 T 细胞极性、迁移和趋化性异常相关的细胞骨架组织紊乱，表明 CARMIL2 是 T 细胞中细胞骨架动力学的关键调节因子。所有这些因素导致全球 T 细胞免疫力受损。但可以用 IL2 来挽救（147680）。与对照组相比，患者细胞表现出 CD28 介导的共信号传导受损，下游经典 NFKB 通路激活减少，以及对 EBV 反应的增殖和细胞因子产生减少。患者细胞还表现出与 T 细胞极性、迁移和趋化性异常相关的细胞骨架组织紊乱，表明 CARMIL2 是 T 细胞中细胞骨架动力学的关键调节因子。所有这些因素导致全球 T 细胞免疫力受损。但可以用 IL2 来挽救（147680）。与对照组相比，患者细胞表现出 CD28 介导的共信号传导受损，下游经典 NFKB 通路激活减少，以及对 EBV 反应的增殖和细胞因子产生减少。患者细胞还表现出与 T 细胞极性、迁移和趋化性异常相关的细胞骨架组织紊乱，表明 CARMIL2 是 T 细胞中细胞骨架动力学的关键调节因子。所有这些因素导致全球 T 细胞免疫力受损。患者细胞还表现出与 T 细胞极性、迁移和趋化性异常相关的细胞骨架组织紊乱，表明 CARMIL2 是 T 细胞中细胞骨架动力学的关键调节因子。所有这些因素导致全球 T 细胞免疫力受损。患者细胞还表现出与 T 细胞极性、迁移和趋化性异常相关的细胞骨架组织紊乱，表明 CARMIL2 是 T 细胞中细胞骨架动力学的关键调节因子。所有这些因素导致全球 T 细胞免疫力受损。

Alazami 等人在来自 3 个不相关的沙特近亲家庭的 7 名 IMD58 患者中（2018） 鉴定了 CARMIL2 基因的纯合突变（610859.0007 和 610859.0008）。第一个家族的突变是通过自合性作图和全外显子组测序相结合发现的，并通过桑格测序证实，其余2个家族的突变是通过CARMIL2基因的直接桑格测序发现的。患者细胞显示出突变型 CARMIL2 蛋白的缺失，这与功能丧失一致。

排除研究

Matsuzaka 等人通过对 8 名银屑病患者和 8 名对照者的 RLTPR 基因进行测序，（2004） 鉴定了 13 个 SNP。在 85 名日本银屑病患者和 110 名对照者中，微卫星标记 RLTPR-47433_MS 与银屑病没有显着相关性。

▼ 进化

Lanier 等人（2016） 发现，在含有 CP 相互作用基序的蛋白质中，非结构化碱性/疏水性膜结合域是 CARMIL 家族成员所独有的。所有 3 个 CARMIL 在同一位置均具有膜结合结构域，并且碱性残基和疏水残基的位置是保守的。鸟类、鱼类和爬行动物的膜结合结构域与哺乳动物的膜结合结构域略有不同，但碱性和疏水残基的取代很大程度上是保守的。然而，CARMIL 同种型中碱性或疏水残基的位置并不保守，这表明 CARMIL 的膜结合结构域在进化过程中发生了分歧，并且可能已经发展出其独特的功能。

▼ 动物模型

使用 N-乙基-N-亚硝基脲筛选，Liang 等人（2013） 在 Rltpr 中发现了一个点突变，称为“Basilic”（Bas），它消除了 Lat 基因（602354） 中 tyr136-to-phe（Y136F） 突变的小鼠的淋巴增殖性疾病。Bas 突变不影响 Rltpr 与肌节蛋白加帽蛋白的结合。带有 Bas 突变的小鼠表型复制了 Cd28 -/- 小鼠，包括类似的 T 细胞功能缺陷。野生型和 Rltpr-Bas T 细胞中磷酸化蛋白的比较表明，Bas 突变不影响 Cd28 孤立信号传导，进一步表明 Bas 突变仅选择性影响 Cd28 共刺激途径。Rltpr 微簇以 Cd80（112203） 依赖性方式形成，并与免疫突触处的 Cd28 微簇共定位，Bas突变并没有损害Rltpr的这一功能。进一步分析表明，Rltpr可以在中央超分子激活复合物处易位并积累PKC-theta（PRKCQ；600448）和Carma1（CARD11），将Cd28与PKC-theta和Carma1连接起来，而Bas突变废除了Rltpr的这一功能。作者还发现，Rltpr 控制 T 细胞中 Cd28 的内化，并且 Rltpr-Bas T 细胞比野生型细胞具有更多的抗体诱导的 Cd28 内化。

▼ 等位基因变异体（8 个选定示例）：.

0001 免疫缺陷 58
CARMIL2、LEU372ARG
Wang 等人在 3 名同胞中，由近亲摩洛哥父母（A 家庭）所生，患有免疫缺陷 58（IMD58；618131）（2016） 在 CARMIL2 基因的外显子 14 中发现了纯合 c.1115T-G 颠换，导致 LRR 结构域中高度保守的残基处由 leu372 替换为 arg（L372R）。该突变是通过连锁分析和全外显子组测序相结合发现的，并通过桑格测序证实，与家族中的疾病分离。在 dbSNP、1000 基因组计划、外显子组变异服务器或 ExAC 数据库或包含 3,000 多个外显子组的内部数据库中均未发现该基因。患者来源的 B 细胞的蛋白质印迹分析显示突变蛋白的表达降低（对照值的 20%）。

.0002 免疫缺陷 58
CARMIL2、GLN853TER
Wang 等人在 2 名同胞中，由近亲突尼斯父母（B 族）所生，患有免疫缺陷 58（IMD58；618131）（2016） 在 CARMIL2 基因的外显子 25 中发现了纯合 c.2557C-T 转换，导致同源二聚化结构域中出现 gln853-to-ter（Q853X） 取代。该突变是通过连锁分析和全外显子组测序相结合发现的，并通过桑格测序证实，与家族中的疾病分离。在 dbSNP、1000 基因组计划、外显子组变异服务器或 ExAC 数据库或包含 3,000 多个外显子组的内部数据库中均未发现该基因。对患者来源的 B 细胞进行的蛋白质印迹分析显示不存在突变蛋白，但作者指出，所使用的抗体靶向 C 末端；因此，不能排除截短蛋白的表达。

.0003 免疫缺陷 58
CARMIL2，LEU525GLN
一名 18 岁男孩，由无关的土耳其父母（C 家庭）出生，患有免疫缺陷 58（IMD58；618131），Wang 等人（2016） 在 CARMIL2 基因的外显子 17 中发现了纯合 c.1574T-A 颠换，导致 LRR 结构域中高度保守的残基处由 leu525 替换为 gln（L525Q）。该突变是通过连锁分析和全外显子组测序相结合发现的，并通过桑格测序证实，与家族中的疾病分离。在 dbSNP、1000 基因组计划、外显子组变异服务器或 ExAC 数据库或包含 3,000 多个外显子组的内部数据库中均未发现该基因。患者来源的 B 细胞的蛋白质印迹分析显示突变蛋白的表达降低（对照值的 35%）。

.0004 免疫缺陷 58
CARMIL2、LEU639HIS
Sorte 等人在来自挪威 3 个不相关家庭的 4 名患有免疫缺陷 58（IMD58; 618131） 的患者中（2016） 在 CARMIL2 基因中鉴定出纯合的 c.1916T-A 颠换（c.1916T-A，NM_001013838），导致 LRR 结构域中高度保守的残基处由 leu639 替换为 his（L639H）。这种突变是通过外显子组测序发现的，并通过桑格测序证实，在有父母或同胞 DNA 的家庭中与该疾病分离。该变体在 dbSNP 或外显子组测序项目数据库中未发现，但在 ExAC 数据库中以杂合状态出现频率较低（0.0001401）。在排除与相似表型相关的候选基因突变后进行外显子组测序。单倍型分析表明存在创始人效应。没有进行变体的功能研究和患者细胞的研究，但 Sorte 等人（2016） 指出，突变发生在疏水核心区域，可能会破坏 3 维结构的稳定性并破坏蛋白质功能。

.0005 免疫缺陷 58
CARMIL2，1-BP INS，489G
2 个姐妹，由来自也门的近亲父母出生（家庭 1），患有免疫缺陷 58（IMD58；618131），Schober 等人（2017） 在 CARMIL2 基因中发现了一个纯合 1-bp 插入（c.489insG），导致移码和提前终止（Glu163fsTer4）。该突变是通过纯合性作图和全外显子组测序相结合发现的，并通过桑格测序证实，与该家族中的疾病分离。患者淋巴细胞显示出 CARMIL2 蛋白的缺失，这与功能完全丧失一致。

.0006 免疫缺陷 58
CARMIL2、IVS11DS、GT、+1
2 个兄弟，由巴西近亲父母出生（家庭 2），患有免疫缺陷 58（IMD58；618131），Schober 等人（2017） 鉴定了 CARMIL2 基因（c.871+1G-T） 内含子 11 中的纯合 G 到 T 颠换，导致剪接位点畸变并跳过外显子 11，导致移码和过早终止（Asp260fsTer70）。该突变是通过纯合性作图和全外显子组测序相结合发现的，并通过桑格测序证实，与该家族中的疾病分离。患者淋巴细胞显示缺乏外显子 11 的剪接产物，免疫印迹显示不存在 CARMIL2 蛋白，这与功能完全丧失一致。

.0007 免疫缺陷 58
CARMIL2，13-BP DEL，NT2536
Alazami 等人对来自 2 个不相关的沙特近亲家庭（F1 和 F2）的 5 名患有免疫缺陷 58（IMD58；618131）的患者进行了研究（2018） 在 CARMIL2 基因中发现了一个纯合 13 bp 缺失（c.2536_2548del, NM_001013838.1），导致移码和提前终止（Leu846SerfsTer36）。该突变是通过自合性作图和全外显子组测序相结合发现的，并通过第一家庭的桑格测序证实，与该家庭中的疾病分离。该变异是通过对第二个家族的 CARMIL2 基因进行直接桑格测序发现的，但并未进行分离研究。单倍型分析表明存在创始人效应。对患者细胞的分析表明，突变导致无义介导的 mRNA 衰减，并且无法检测到截短的蛋白质。

.0008 免疫缺陷 58
CARMIL2、ARG50THR
在 2 名同胞中，由近亲沙特父母（家庭 F3）出生，患有免疫缺陷 58（IMD58；618131），Alazami 等人（2018） 在 CARMIL2 基因中鉴定出纯合 c.149G-C 颠换（c.149G-C, NM_001013838.1），导致高度保守残基处的 arg50 至 thr（R50T） 取代。该突变是通过 CARMIL2 基因的桑格测序发现的，与该家族中的疾病分离，并且在 ExAC 数据库或本地数据库中没有发现。对患者细胞的分析显示 mRNA 表达下降，并且没有检测到蛋白质，这表明突变导致蛋白质不稳定，与功能丧失一致。