Timeless昼夜节律调节器; TIMELESS
Timeless，果蝇，同源物
TIM; TIM1
HGNC 批准的基因符号：TIMELESS
细胞遗传学定位：12q13.3 基因组坐标（GRCh38）：12:56,416,363-56,449,426（来自 NCBI）
▼ 克隆与表达
位于下丘脑前部视交叉上核（SCN）的细胞起搏器控制昼夜节律。在果蝇中，中央时钟机制涉及两个基因的动态调节，“period”（per; 参见 602260）和“timeless”（tim），它们物理上相互作用并参与细胞内转录/转录反馈循环。per和tim的转录受到Clock（601851）和BMAL1（602550）蛋白的正向调控，形成异二聚体。Sangoram et al.（1998）、Zylka et al.（1998）和Koike et al.（1998）通过检索EST数据库，鉴定出了果蝇timeless的人类（TIM）和老鼠（Tim）同源物对应的cDNA。Sangoram等人（1998）报道预测的1,208个氨基酸的人类蛋白质与小鼠Tim有84%相同。哺乳动物蛋白与果蝇 tim 有 4 个同源区域，包括参与核定位、与 PER 的蛋白质-蛋白质相互作用以及细胞质定位的区域。Northern 印迹分析显示，TIM 在所有测试的人体组织中均以 4.5 kb mRNA 的形式表达，其中在胎盘、胰腺、胸腺和睾丸中表达水平最高。原位杂交表明，与果蝇不同，小鼠 Tim 转录水平在 SCN 或视网膜中不会振荡。
▼ 基因功能
Sangoram等人（1998）在体外证明了人类TIM与果蝇per、小鼠Per1和小鼠Per2（见603426）相互作用。当在果蝇细胞中表达时，TIM 通过与果蝇相互作用并易位到细胞核中来模仿果蝇 tim 细胞功能。此外，当在哺乳动物细胞中表达时，人TIM和毛发PER1特异性抑制CLOCK-BMAL1诱导的毛发PER1启动子反式激活。这些作者得出结论，TIM 和 Tim 是果蝇 tim 的哺乳动物直系同源物。相反，Zylka 等人（1998）无法在酵母 2-hybrid 检测中检测到 小鼠 Per-Tim 相互作用。他们发现了各种 miRNA Per 蛋白之间的一系列相互作用，并表明 Per-Per 相互作用已经取代了哺乳动物生物钟分子运作中 Per-Tim 二聚体的功能。
Chan et al.（2003）发现线虫TIM1参与染色体凝聚力的调节。他们的生化实验定义了线虫粘连蛋白复合物，并揭示了它与 TIM1 的物理关联。相互作用的功能相关性通过 TIM1 或粘连蛋白破坏引起的异常有丝分裂染色体行为、胚胎致死性和减数分裂染色体凝聚力缺陷得到证实。TIM1缺失阻止了非SMC（染色体结构维持）粘连子单元组装到减数分裂染色体上；然而，出乎意料的是，由 SMC 成分组成的部分粘连蛋白复合物仍然被加载。通过同时耗竭 TIM1 和 SMC 子单元进一步破坏减数分裂中的粘连蛋白活性，减少了突触前的同源染色体配对，揭示了粘连蛋白在后生动物中的新作用。Chan等人（2003）在比较蠕虫、苍蝇和小鼠中TIMELESS同源物的基础上提出，细胞内聚力而不是生物钟调节是TIMELESS样蛋白古老而保守的功能。
Barnes等人（2003）证明，大鼠SCN中TIM蛋白表达的条件性敲低会扰乱SCN神经元活动节律并改变核心时钟元件的水平。全长大鼠 TIM 蛋白表现出 24 小时振荡，而截短的异构体则组成型表达。全长大鼠 TIM 蛋白与哺乳动物时钟周期蛋白（PER1、PER2 和 PER3（603427））相关。数据表明，小鼠 Timeless 是节律所必需的，并且是果蝇 timeless 在哺乳动物分子发条负反馈臂上的功能同源物。
通过酵母2-杂交分析，Gotter（2003）将小鼠Tipin（610716）鉴定为Tim相互作用蛋白。免疫共沉淀分析表明，Tipin 在体外和培养细胞中与 Tim 相互作用。在瞬时转染的细胞中，Tim 促进了 Tipin 的核定位。免疫沉淀实验表明，Tipin 破坏了 Tim 形成同源多聚体复合物的能力，这表明 Tipin 可能调节 Tim 功能的机制。
Chou 和 Elledge（2006）表明，TIPIN 和 TIM 形成了一种复合物，可以维持人体细胞中两种蛋白质的水平，并且其中一种蛋白的缺失会导致另一种蛋白的缺失。
Busza et al.（2004）表明果蝇CRY（601933）在果蝇中与TIM的结合是光依赖性的，并且不可逆地使TIM被蛋白酶体降解。相反，CRY 降解取决于连续光照，表明 CRY-TIM 相互作用是短暂的。一种新的 CRY 突变表明，CRY 的光裂合酶同源结构域足以进行光检测和光转导，而羧基末端结构域则调节 CRY 稳定性、CRY-TIM 相互作用和昼夜节律光敏性。
通过使用荧光形式的 PER（602260）和 TIM 的单细胞成像测定进行荧光共振能量转移测量，Meyer 等人（2006）表明这些蛋白质快速结合并持续存在于细胞质中，同时逐渐积累在离散的焦点中。大约 6 小时后，复合物突然解离，因为 PER 和 TIM 在很短的时间内孤立地移动到细胞核。per（l）突变会在果蝇大脑起搏细胞中产生延迟核易位表型，延迟体内和培养细胞系统中的核积累，但不影响PER/TIM组装或解离的速率。Meyer 等人（2006）得出的结论是，他们的发现指出了一种以前未被认识的时间调节形式，它是生物钟周期性的基础。
Koh et al.（2006）鉴定出果蝇时差反应突变（FBXL15；参见 610287），编码具有富含亮氨酸重复序列的 FBOX 蛋白的基因，导致生物钟的光敏感性降低。突变果蝇在恒定光下表现出有节律的行为，响应光脉冲的相移减少，并且 TIM 的光依赖性降解减少。Jet 和 CRY 在培养细胞中的表达赋予 TIM 光依赖性降解，从而在细胞培养系统中重建生物钟对光的急性反应。Koh等人（2006）得出的结论是，他们的结果表明JET对于通过将光信号从CRY传输到TIM来重置时钟至关重要。
Tauber等人（2007）报告说，黑腹果蝇的生物钟基因中的一个突变ls-tim最近在欧洲通过自然选择出现并遗传，大约在8,000到10,000年前，与冰河后时期一致。随后黑腹果蝇在欧亚大陆的殖民化。作者发现，当引入不同的遗传背景时，Timeless基因的天然和人工等位基因会影响滞育的发生率，以响应光和温度的变化。自然突变等位基因改变了一个重要的生活史特征，可能会增强果蝇对季节条件的适应。
滞育是对不利环境的保护性反应，导致昆虫发育暂停，通常与冬季的到来有关。黑腹果蝇生物钟基因中的 ls-tim 突变在过去一万年中已在欧洲遗传，可能是因为它会促进滞育。Sandrelli等人（2007）表明，突变等位基因减弱了生物钟的光敏性，并导致突变Timeless蛋白亚型与昼夜光感受器隐花色素（601933）的二聚化减少。这种相互作用产生了更稳定、Timeless产品。Sandrelli 等人（2007）得出的结论是，他们的发现揭示了滞育与昼夜节律光感受之间的分子联系。
Yoshizawa-Sugata 和 Masai（2007）利用 HeLa 和 U2OS 人类细胞系发现 TIM 和 TIPIN 可以相互稳定。任一蛋白质的敲低都会降低总蛋白质含量并导致另一种蛋白质的细胞质重新分布。S 期内检查点需要 TIPIN。TIM和TIPIN均促进claspin的核积累（CLSPN; 605434）并激活CHK1（CHEK1; 603078）以下复制压力。
Somyajit et al.（2017）发现，人类核糖核苷酸还原酶（参见 RRM1, 180410）的扰动会升高过氧化还原蛋白-2（PRDX2）检测到的活性氧（ROS）；600538）。在寡聚状态下，PRDX2 形成复制体相关的 ROS 传感器，当暴露于低水平的 ROS 时，它会与叉加速器 TIMELESS 结合。RNR 衰减产生的 ROS 水平升高会破坏寡聚化的 PRDX2 形成较小的子单元，其与染色质的解离迫使 TIMELESS 从复制体中移位。这个过程立即减慢了复制叉的进展，从而减轻了复制压力的病理后果。因此，Somyajit et al.（2017）得出结论，氧化还原信号将脱氧核苷酸三磷酸（dNTP）生物合成的波动与复制体活性结合起来，以减少基因组复制过程中的应激。作者提出，癌细胞利用这一途径来增强其对不利代谢条件的适应性。
▼ 测绘
通过种间回交分析，Sangoram et al.（1998）将小鼠 Tim 基因定位到染色体 10。利用辐射杂交分析，这些作者将人类 TIM 基因定位到人类染色体 12，在与小染色体具有同线性同源性的区域中鼠染色体10。Koike et al.（1998）通过荧光原位杂交将基因位置细化为人类染色体12q12-q13和小鼠染色体10D3。
▼ 分子遗传学
通过对患有家族性晚期睡眠阶段综合征（FASPS4；620015），Kurien et al.（2019）在TIMELESS基因（R1081X；R1081X；603887.0001）。该突变导致蛋白质在细胞质中积累。该突变蛋白对 CRY2（603732）的亲和力发生改变，导致 PER2（603426）-CRY2 异二聚体不稳定。该突变与家族中的表型分离，并且在公共变异数据库中未发现。
▼ 动物模型
Kurien等人（2019）利用CRISPR产生了Tim基因中带有杂合R1078X突变的小鼠，对应于人类R1081X突变（603887.0001）。突变小鼠表现出提前的睡眠阶段，对光脉冲的敏感性改变，但昼夜节律长度正常。
▼ 等位基因变异体（1个精选示例）：
.0001 高级睡眠阶段综合症，家族性，4（1个家庭）
Timeless，ARG1081TER
通过对患有家族性晚期睡眠时相综合征-4（FASP4；620015），Kurien et al.（2019）在TIMELESS基因的27号外显子中发现了一个杂合CT转换，导致arg1081-to-ter（R1081X）取代，并导致C端128个氨基酸丢失。保守的C结构域，含有核定位信号（NLS4）。该突变导致蛋白质在细胞质中积累。该突变蛋白对 CRY2（603732）的亲和力发生改变，导致 PER2（603426）-CRY2 异二聚体不稳定。该突变与家族中的表型分离，并且在公共变异数据库中未发现。
