端粒重复结合因子 2；TERF2

TRF2

HGNC 批准的基因符号：TERF2

细胞遗传学定位：16q22.1 基因组坐标（GRCh38）：16:69,355,567-69,386,007（来自 NCBI）

▼ 克隆与表达

人类端粒由 TTAGGG 重复序列的长阵列组成，这些重复序列形成保护和复制染色体末端所需的核蛋白复合物。人类端粒的组成部分之一是TTAGGG重复结合因子-1（TRF1；600951），一种与原癌基因 Myb（189990）相关的普遍表达的蛋白质，存在于整个细胞周期的端粒处。TRF1 参与端粒长度的控制。它作为端粒酶抑制剂发挥作用，以顺式作用限制个体染色体末端的伸长。Broccoli等人（1997）报道了TRF2的克隆，TRF2是TRF1的远缘同源物，携带非常相似的Myb相关DNA结合基序（也称为“telobox”）。与 TRF1 一样，TRF2 普遍表达，在体外与双链 TTAGGG 重复序列特异性结合，并定位于中期染色体中的所有人类端粒。TRF2 具有与 TRF1 相似的结构，因为它携带 C 端 Myb 基序和靠近 N 端的大 TRF1 相关二聚化结构域。然而，TRF1 和 TRF2 的二聚化结构域不相互作用，表明这些蛋白质主要以同二聚体形式存在。虽然具有相似的端粒结合活性和结构域组织，但 TRF2 与 TRF1 的不同之处在于其 N 末端是碱性而非酸性，并且 TRF2 比 TRF1 保守得多。由于TRF1和TRF2之间的差异，Broccoli等人（1997）认为这些因子在端粒上具有不同的功能。Bilaud等人（1997）孤立地鉴定了第二个人类开放解读码组，其中包含端粒框序列并编码在体外特异性识别哺乳动物端粒重复DNA的多肽。他们表明，在 HeLa 细胞中表达的两种 65 kD 和 69 kD 的蛋白质含有第二个端位框序列。这些蛋白质统称为 TRF2。亲和纯化的抗 TRF2 特异性抗体标记了完整人类染色体的端粒，增强了端粒框发生与体内端粒重复识别之间的相关性。

▼ 测绘

Sakaguchi et al.（1998）通过单染色体定位组和辐射杂交组的分析，将TERF2基因定位到染色体16q22.1。小鼠Terf2基因定位于染色体8，定位于至少由25个基因组成的大型进化保守连锁群。

▼ 基因功能

Van Steensel等（1998）表明，人类端粒蛋白TRF2在端粒保护活性中起着关键作用。TRF2 的显性失活等位基因诱导在中期和后期细胞中可检测到的端到端染色体融合。端粒 DNA 在融合处持续存在，表明 TTAGGG 重复本身不足以保证端粒完整性。分子分析表明，融合代表了失去单链 G 尾的端粒的连接。Van Steensel等（1998）得出结论，TRF2可能通过维持端粒末端的正确结构来保护染色体末端。此外，TRF2突变形式的表达诱导了具有衰老特征的生长停滞。这些结果提出了原代人类细胞中染色体末端融合和衰老可能是由缩短的端粒导致的 TRF2 丢失引起的可能性。

Griffith等（1999）利用电子显微镜证明TRF2可以在体外将线性端粒DNA重塑为大的双链体环（tloop）。对从人和小鼠细胞中纯化的补骨脂素交联端粒 DNA 进行电子显微镜分析，发现大量的大 t 环，其大小分布与其端粒起源一致。TRF1 和单链 DNA 结合蛋白（600439）的结合表明 t 环是通过 3 素端粒突出端侵入双链体端粒重复阵列而形成的。Griffith et al.（1999）得出结论，t环可能为端粒的保护和复制提供通用机制。

端粒使细胞能够区分自然染色体末端和受损DNA，并保护末端免于降解和融合。在人类细胞中，端粒保护依赖于 TTAGGG 重复结合因子 TRF2，该因子可能将端粒重塑为 t 环。Zhu等人（2000）证明了RAD50/MRE11/NBS1复合物（见604040）与TRF2和人类端粒的细胞周期调节关联。尽管 MRE11 复合物响应 γ 辐射而在辐射诱导灶（IRIF）中积累，但 TRF2 并未重新定位到 IRIF，并且辐射不影响 TRF2 与 MRE11 复合物的结合，这反对 TRF2 在双链中的作用破损修复。Zhu et al.（2000）提出RAD50/MRE11/NBS1复合物在端粒上发挥作用，可能是通过调节t环的形成。

在哺乳动物细胞中，DNA依赖性蛋白激酶（600899）活性终止端粒重复结合因子TRF2会导致染色体端到端融合，从而确立这些蛋白质在端粒功能中的核心作用。Bailey等人（2001）证明TRF2介导的封端发生在端粒复制后。TRF2 和 DNA-PK 催化子单元的复制后需求仅限于一半端粒，即由前导链 DNA 合成产生的端粒。Bailey等人（2001）得出的结论是，他们的结果表明端粒复制后加工的关键差异与其复制模式有关。

Karlseder et al.（2002）报道，TRF2的过度表达增加了原代细胞端粒缩短的速度，但没有加速衰老。TRF2 将衰老设定点（定义为衰老时的端粒长度）从 7 kb 降低至 4 kb。TRF2 保护极短的端粒免于融合，并抑制衰老前培养物中的细胞末端融合，这解释了 TRF2 延迟衰老的能力。因此，Karlseder et al.（2002）得出结论，复制性衰老是由缩短的端粒保护状态的变化引起的，而不是由端粒DNA的完全丧失引起的。

Opresko et al.（2002）发现TRF2与RecQ DNA解旋酶WRN（604611）共定位并发生物理相互作用，并且这种相互作用是由WRN的RecQ保守C端区域介导的。在体外，TRF2 对 WRN 和第二个 RecQ DNA 解旋酶 BLM（RECQL3；604610）。TRF2 与任一解旋酶的相互作用都会刺激其活性。WRN 或 BLM 解旋酶与复制蛋白 A（参见 179835）配合，主动解开 TRF2 预先结合的长端粒双链体区域。Opresko et al.（2002）得出结论，TRF2 在端粒末端的共同途径中与 WRN（可能还有 BLM）一起发挥作用。

端粒酶阴性的永生化人类细胞通过端粒（ALT）途径的选择性延长来维持端粒，这可能涉及同源重组（Bryan et al., 1997）。Stavropoulos et al.（2002）发现内源性BLM蛋白与ALT人类细胞中的端粒病灶共定位，但在端粒酶阳性的永生细胞系或原代细胞中不存在。通过 FRET 和免疫共沉淀检测到，BLM 在体内与 ALT 细胞中的端粒蛋白 TRF2 相互作用。GFP-BLM 的瞬时过度表达导致端粒 DNA 显着的 ALT 细胞特异性增加。BLM 与端粒的关联及其对端粒 DNA 合成的影响需要功能性解旋酶结构域。作者认为，BLM 可能有助于 ALT 细胞中重组驱动的端粒扩增。

Wang等人（2004）报道了一种缺乏N端基本结构域的TRF2突变体，称为TRF2（δ-B），它抑制了非同源末端连接，但诱导了端粒DNA的灾难性缺失。缺失事件是随机的并且发生迅速，产生显着缩短的端粒，并伴随着DNA损伤反应和衰老诱导。TRF2（δ-B）诱导的缺失依赖于XRCC3（600675），一种与霍利迪连接体解析有关的蛋白质，并产生T环大小的端粒环。在未受干扰的细胞中也检测到了这些端粒环，表明同源重组导致的 t 环缺失可能导致端粒磨损。人类 ALT 细胞具有丰富的端粒环，表明频繁的 T 环同源重组事件可以在端粒酶缺失的情况下促进端粒的滚环复制。

除了DNA链交换增加之外，缺乏BLM的Bloom综合征（210900）细胞的另一个细胞遗传学特征是端粒联合的倾向。Lillard-Wetherell et al.（2004）报道BLM在使用ALT的细胞中与TERF2共定位并复合。BLM 与 TERF2 共定位于 S 晚期和 G2/M 期间活跃合成 DNA 的病灶中；当 ALT 被认为发生时，共定位在 S 晚期和 G2/M 期增加。TERF1（600951）和TERF2在体外直接与BLM相互作用并调节其解旋活性。TERF2 刺激端粒和非端粒底物的 BLM 解旋，而 TERF1 仅抑制端粒底物的解旋。TERF2 用等摩尔浓度的 TERF1 刺激 BLM 解旋，但当添加摩尔过量的 TERF1 时则不会刺激 BLM 解旋。Lillard-Wetherell等人（2004）提出了BLM在重组介导的端粒延长中的功能，以及TERF1和TERF2协调调节端粒BLM活性的模型。

人类细胞中的 DNA 损伤监控网络可以响应每个基因组少于 4 个双链断裂（DSB）而激活 DNA 修复、细胞周期检查点和细胞凋亡。这些相同的网络能够容忍端粒，部分原因是蛋白质 TRF2 通过促进端粒末端组织成 t 环来防止将端粒末端识别为 DSB。Bradshaw et al.（2005）表明，TRF2 在照射后 2 秒内与人成纤维细胞中非端粒 DNA 中的光诱导 DSB 相关联。这些和其他结果表明 TRF2 参与 DSB 识别和处理的初始阶段，该阶段发生在 ATM（607585）与 DSB 关联以及 ATM 依赖的 DSB 响应网络激活之前。

裂殖酵母裂殖酵母中的端粒重复序列与 Taz1 结合，Taz1 是多种端粒功能的调节因子。Miller 等人（2006）表明 Taz1 对于通过端粒的有效复制叉进展至关重要。Miller等人（2006）利用二维凝胶电泳发现，Taz1的丢失会导致端粒和内部端粒序列的复制叉停滞，无论端粒富含G链是通过前导链还是滞后链复制合成。相比之下，Taz1相互作用蛋白Rap1（605061）对于有效的端粒叉进展是可有可无的。端粒酶丢失后，Taz1-δ 端粒急剧丢失，这表明 Taz1-δ 端粒重复的维持不能通过半保守复制来维持。由于人类端粒蛋白TRF1和TRF2是Taz1直系同源物，Miller等人（2006）预测，人类端粒蛋白中的一个或两个可能协调人类端粒的分叉通道。功能失调的人类端粒上的停滞叉可能会加速驱动肿瘤发生的基因组不稳定性。

Lenain等人（2006）利用酵母2-杂交和蛋白质pull-down实验表明，人类Apollo的N末端（DCLRE1B；609683）以不依赖DNA的方式结合TRF2。Apollo 端粒定位需要 TRF2。

Williams等人（2007）观察到，在光敏染料存在的情况下，高强度多光子激光束引起的HeLa细胞中DNA损伤位点被荧光标记的TERF2募集，这与Bradshaw等人的结果一致.（2005）. 然而，在人类细胞和细胞系中，由更传统的激光束、或暴露于 α 粒子辐射或紫外 C 光引起的 DNA 损伤部位并没有引起 TERF2 的募集。Williams et al.（2007）得出结论，DNA 双链断裂不足以启动 TRF2 的募集。

哺乳动物端粒受到 6 蛋白复合物庇护蛋白的保护。Shelterin 含有 2 个密切相关的蛋白质，TRF1（600951）和 TRF2，它们将各种蛋白质招募到端粒上。Chen等人（2008）剖析了TRF1和TRF2与其共享结合伙伴TIN2（604319）和其他shelterin辅助因子的相互作用。TRF1 使用其 TRF 同源域中的保守分子表面来识别 TIN2。然而，该表面并不充当TRF2中的TIN2结合位点，并且TIN2与TRF2的结合是由TRF同源结构域之外的区域介导的。相反，TRF2 的 TRF 同源结构域对接位点结合了庇护蛋白辅助因子 Apollo，该因子不与 TRF1 的 TRF 同源结构域相互作用。相反，TRF1 的 TRF 同源结构域（而非 TRF2）与另一种庇护蛋白相关因子 PINX1（606505）相互作用。

Sfeir et al.（2010）通过基因删除或用不结合 Rap1 的突变体替换 Trf2，从 s 端粒中去除了 Rap1。Rap1 对于 Trf2 的基本功能（ATM 激酶信号传导和非同源末端连接的抑制）来说是可有可无的，并且缺乏端粒 Rap1 的小鼠能够存活并具有生育能力。然而，Rap1 对于抑制同源定向修复至关重要，同源定向修复可以改变端粒长度。Sfeir等人（2010）的数据揭示了端粒的同源定向修复可以在没有DNA损伤灶的情况下发生，并强调了shelterin内的功能区划。

Ye等人（2010）表明，TRF2刺激Apollo针对单链端粒DNA的核酸外切酶活性，但不刺激针对模拟端粒DNA末端的双链底物的活性。两种蛋白均结合人工整合到染色体 4q 中部的 800 bp 端粒序列。TOP2-α的抑制或敲低导致端粒缺陷（TOP2A；126430）被Apollo和TRF2的过度表达所拯救。Apollo 和 TRF2 的过度表达减少了端粒复制对 TOP2-α 的需求。Ye et al.（2010）发现TRF2优先结合正超螺旋DNA。他们假设 TRF2-Apollo 和 TOP2 协同作用，释放复制叉进展过程中端粒 DNA 中产生的正超螺旋应变。

为了明确端粒末端保护问题，Sfeir和de Lange（2012）通过在非同源末端连接（NHEJ）缺陷细胞中条件性删除TRF1和TFR2，从小鼠端粒中去除了整个shelterin复合物。数据揭示了在删除单个庇护蛋白后迄今为止未观察到的 2 种 DNA 损伤反应途径。当Ku70/80（152690/194364）缺失时，无庇护蛋白的端粒由微同源介导的替代NHEJ加工，当53BP1（605230）缺失时，无庇护蛋白端粒受到溶核降解的攻击。Sfeir and de Lange（2012）得出结论，他们的数据证实了末端保护问题是由6条通路（ATM和ATR信号、经典-NHEJ、alt-NHEJ、同源重组和切除）指定的，并展示了shelterin如何与一般DNA损伤反应因子可以解决这个问题。

Okamoto et al.（2013）阐述了 TRF2 的分子特性，这些特性对于保护小鼠胚胎成纤维细胞中的染色体末端是必要且充分的，并指出他们的数据支持 TRF2 介导的末端保护的两步机制。首先，TRF2的二聚化结构域需要抑制ATM（607585）激活，这是DNA损伤反应（DDR）激活的关键初始步骤。接下来，TRF2 孤立抑制 ATM 激活下游 DNA 损伤信号的遗传。这种端粒 DDR 的新颖调节发生在 E3 泛素连接酶 RNF168（612688）水平。端粒RNF168的抑制涉及去泛素化酶BRCC3（300617）和泛素连接酶UBR5（608413），足以抑制染色体端到端融合。Okamoto et al.（2013）得出结论，这种 TRF2 介导的末端保护的两步机制有助于解释 DDR 蛋白在功能性端粒上频繁定位而不同时诱导有害 DNA 修复活性的明显悖论。

Grammatikakis et al.（2016）指出，在啮齿类动物中，选择性剪接会产生一个短的Trf2变体Trf2s，它仅包含外显子7的一部分。Trf2s蛋白缺乏全长Trf2和Trf2的DNA结合域和核定位信号。相反，它具有将 Trf2 保留在细胞质中的短序列。Trf2s能够与细胞质中的Rest（600571）结合并使其失活，从而导致神经元基因去抑制。Grammatikakis et al.（2016）通过对大鼠小脑提取物进行蛋白质组筛选，发现RNA结合蛋白Hnrnph1（601035）和Hnrnph2（300610）与Trf2前mRNA的外显子7相互作用。HNRNPH 蛋白抑制外显子 7 中 5-prime 选择性剪接位点的使用，促进外显子 7 的包含，从而增加全长 Trf2 的相对水平并降低 Trf2s 丰度。HNRNPH 蛋白水平在神经元分化过程中降低，而 Trf2s 水平升高。CRISPR 介导的 Hnrnph2 缺失加速了神经元分化。Grammatikakis et al.（2016）得出结论，HNRNPH1和HNRNPH2至少部分通过抑制TRF2的选择性剪接来抑制神经元分化。

Sarek等人（2019）在shelterin子单元TRF2的ser365处鉴定出了CDK磷酸化位点。S期TRF2被PP6R3磷酸酶去磷酸化（SAPS3; 610879）提供了一个狭窄的窗口，在此期间RTEL1（608833）解旋酶可以短暂地进入和解开T环以促进端粒复制。TRF2 在 S 期之外的 Ser365 处重新磷酸化是从端粒释放 RTEL1 所必需的，这不仅可以保护 T 环免于混杂解旋和 ATM 的不当激活，还可以抵消端粒内和整个基因组中出现的 DNA 二级结构的复制冲突。因此，Sarek 等人（2019）得出结论，TRF2 中的磷酸开关在细胞周期中协调 T 环的组装和分解，从而保护端粒免受复制应激和计划外的 DNA 损伤反应。

▼ 生化特征

TRF1 和 TRF2 是脊椎动物端粒的关键组成部分，并作为同二聚体与双链端粒 DNA 结合。二聚化涉及 TRF 同源（TRFH）结构域，该结构域也介导与其他端粒蛋白的相互作用。Fairall 等人（2001）分别以 2.9 埃和 2.2 埃的分辨率确定了人 TRF1 和 TRF2 二聚化结构域的晶体结构。尽管序列同一性不大，但 2 个 TRFH 结构域具有相同的完全 α 螺旋结构，类似于扭曲的马蹄铁。二聚化界面具有独特的相互作用，可防止异二聚化。TRF1 的突变分析证实了结构数据，并强调了 TRFH 结构域在二聚化、DNA 结合和端粒定位中的重要性。

▼ 动物模型

Munoz 等人（2005）培育出 K5-Terf2 小鼠，在牛角蛋白 K5 启动子的 5-prime 调控区的控制下表达不同水平的 TRF2，该启动子将 TRF2 靶向表皮的基底细胞和干细胞。这些小鼠具有严重的皮肤对光反应表型，包括皮肤过早恶化、色素沉着过度和皮肤癌增加，类似于人类色素性干皮病综合征（见 278700）。这些小鼠的角质形成细胞对紫外线照射和 DNA 交联剂非常敏感。这些小鼠的皮肤细胞有明显的端粒缩短、端粒 G 链突出消失以及染色体不稳定性增加。这些小鼠的端粒丢失是由 XPF（278760）介导的，XPF 是一种结构特异性核酸酶，参与紫外线诱导的损伤修复，并在患有 1 分子形式着色性干皮病的个体中发生突变。研究结果表明，TRF2 在端粒功能和紫外线诱导的损伤修复之间提供了重要的联系，其改变是基因组不稳定、癌症和衰老的基础。Munoz et al.（2005）表明，许多人类皮肤肿瘤中TRF2的表达增加，进一步强调了TRF2在皮肤癌中的作用。

Blanco等人（2007）利用K5-Terf2小鼠模型表明，Trf2表达增加与端粒酶缺陷相结合会导致上皮癌发生的急剧加速，同时伴随着端粒功能障碍和染色体不稳定性的增加。