CLN3 溶酶体/内体跨膜蛋白，BATTENIN；CLN3

CLN3 基因
BATTENIN

HGNC 批准的基因符号：CLN3

细胞遗传学定位：16p12.1 基因组坐标（GRCh38）：16:28,466,653-28,492,082（来自 NCBI）

▼ 克隆与表达

国际巴顿病联盟（1995）分离出CLN3基因，该基因在巴顿病中发生突变（CLN3；204200）。73% 的巴顿病染色体共有一种特定的单倍型，称为“56 染色体”单倍型，由 D16S299 处的 5 等位基因和D16S298处的 6 等位基因定义。该联盟使用了含有 D16S298 的粘粒的外显子扩增，产生了一个候选基因，该基因在所有携带 56 号染色体的患者中被 1 kb 基因组缺失 ( 607042.0001 ) 破坏。三个独立的缺失和改变 3 个不相关家族中剪接位点的点突变证实了该候选基因为CLN3基因。该疾病基因编码推导的 438 个氨基酸的蛋白质。

简斯等人(1996)报道CLN3基因产物的氨基酸序列预测具有 6 个跨膜结构域的疏水蛋白。该序列似乎在残基 11 处包含假定的线粒体靶向位点，并具有 4 个预测的 N-糖基化位点，全部位于预测的外质表面。同源性搜索发现酵母蛋白与CLN3蛋白具有 36% 的同一性。门罗等人(1997)报道称，所有已知的CLN3点突变均发现于酵母蛋白中具有相同残基的位点。

李等人(1996)分离出CLN3基因的小鼠同源物。与人类对应物一样，小鼠 cDNA 编码预测的 438 个氨基酸的多肽。小鼠和人类蛋白质具有 85% 的序列同一性。

Mao 等人使用免疫沉淀和糖基化诱变程序(2003)确定人类CLN3蛋白含有 5 个跨膜结构域、一个细胞外/腔内 N 末端和一个细胞质 C 末端。

通过蛋白质印迹分析，Margraf 等人(1999)在皮质脑、胰腺、脾脏和睾丸中观察到CLN3的表观分子量为48 kD，在周围神经中表达较弱。灰质的CLN3表达高于白质。在卵巢、小肠、结肠和脂肪组织中未检测到蛋白质表达。免疫细胞化学分析将CLN3定位于胰腺的胰岛细胞中。在大脑中，在大多数星形胶质细胞的细胞核和细胞质突起、神经元的细胞核和细胞质以及毛细血管内皮中观察到CLN3 。所有检查的大脑区域的染色相似，成人和非婴儿大脑的染色没有发现差异。免疫电镜检测到内皮细胞膜上有 CLN2。CLN2 与溶酶体或线粒体无关。

拉赫贾等人(2004)发现Cln3驻留在牛脑的脂筏或耐去垢剂膜上。

▼ 基因结构

米奇森等人(1997)报道CLN3基因至少包含 15 个外显子，跨度 15 kb。CLN3和同源 EST之间的序列比较表明该基因和至少 1 个额外的上游外显子存在选择性剪接。

▼ 测绘

国际巴顿病联盟 (1995)在染色体 16p12.1-p11.2 上的微卫星标记 D16S288 和 D16S383 之间分离出CLN3基因。

李等人(1996)将小鼠基因定位到远端 7 号染色体上与人类 16p12 同线同源的区域。

▼ 基因功能

简斯等人(1996)推测CLN3基因产物可能作为伴侣参与其他蛋白质的折叠/展开或组装/分解，特别是 ATP 合酶复合物的 c 亚基。克雷米迪奥蒂斯等人(1999)通过将CLN3基因产物与绿色荧光蛋白 (GFP) 或 8 个氨基酸肽标签融合并瞬时转染至成纤维细胞、HeLa 细胞和 COS-7 细胞中，研究了 CLN3 基因产物的亚细胞定位。在所有 3 种细胞类型中均观察到与高尔基体相关的核旁不对称定位。一部分细胞在整个细胞质中呈现点状囊泡分布。在仅表达 1 个CLN3 -GFP DNA构建体拷贝的稳定转染细胞系上进行了进一步的研究。荧光和生化分析表明，CLN3基因产物是一种完整的膜蛋白，主要定位于高尔基体。

贾维拉等人(1999)通过免疫电子显微镜将CLN3蛋白与可溶性和膜相关溶酶体蛋白共定位，证实了 CLN3 蛋白的溶酶体定位。他们分析了 2 个突变体的细胞内加工和定位，461-677del ( 607042.0001 )，它存在于 85% 的CLN3等位基因中，导致经典的青少年发病CLN3，而 glu295 为 lys (E295K; 607042.0005 )，这是一种罕见的突变。与非典型 JNCL 形式相关的错义突变。2 个突变体在 BHK 细胞中的瞬时表达表明 461-677del 保留在内质网中，而 E295K 能够到达溶酶体区室。CLN3多肽在小鼠原代神经元中进一步表达，其中野生型CLN3蛋白定位于细胞体和神经元延伸中，而461-677del突变在细胞体中被抑制。野生型CLN3和 E295K 蛋白与突触小泡标记的共定位表明CLN3蛋白可能参与突触小泡转运/传递。这些数据为神经细胞和非神经细胞中巴顿病的经典形式和非典型形式之间的细胞区别提供了明确的证据。

卢罗等人(2001)通过使用原位杂交、免疫组织化学染色和亚细胞组分的蛋白质印迹分析，分析了小鼠大脑中的CLN3 。CLN3在神经元细胞中大量表达，尤其是在成年小鼠大脑的皮质、海马和小脑中。在培养的小鼠视网膜细胞中，CLN3不仅定位于溶酶体，而且也存在于突触体中，尽管不靶向突触小泡。后一个观察结果使作者推测CLN3在神经元转运途径中的潜在作用。

使用表面生物素化和抗体捕获，Mao 等人(2003)表明人畸胎癌细胞系中的一部分CLN3通过细胞膜转运至溶酶体。抑制 AP3 衔接蛋白复合物 (AP3M1; 610366 )的 mu-3A 亚基会增加细胞表面CLN3的量。

卢罗等人(2004)发现CLN3的过度表达可能通过介导其与微管的解离来诱导 HeLa 细胞中微管结合蛋白 Hook1 ( 607820 ) 的聚集。体外结合测定显示 Hook1 与CLN3胞质片段之间的相互作用较弱。CLN3缺陷的 JNCL 成纤维细胞中受体介导的内吞作用存在缺陷，将CLN3、Hook1 和哺乳动物系统中的内吞作用联系起来。免疫共沉淀实验表明，Hook1 与内吞 Rab7 ( 602298 )、Rab9 ( 300284 ) 和 Rab11 ( 605570 ) 发生物理相互作用，表明 Hook1 在膜运输中发挥作用。卢罗等人(2004)提出CLN3功能、微管细胞骨架和内吞膜运输之间的联系。

Ramirez-Montealegre 和 Pearce (2005)报道称，幼年巴顿病淋巴母细胞系的溶酶体表现出精氨酸转运缺陷。此外，他们还发现幼年巴顿病患者的细胞中精氨酸耗尽。Ramirez-Montealegre 和 Pearce (2005)证明，正常溶酶体中的溶酶体精氨酸转运是 ATP、液泡 ATP 酶（参见606939）和阳离子依赖性的。因此，精氨酸和赖氨酸均由同一运输系统（指定为系统c）运输。然而，幼年巴顿病淋巴母细胞的溶酶体仅存在精氨酸转运缺陷。CLN3抗体能够阻断溶酶体精氨酸转运， JNCL 细胞中CLN3的瞬时表达可恢复溶酶体精氨酸转运。Ramirez-Montealegre 和 Pearce (2005)提出，幼年 Batten 病中的CLN3缺陷可能会影响细胞内精氨酸水平的调节或在整个细胞中的分布。

在培养的人类神经母细胞瘤细胞中，Narayan 等人(2006)证明CLN3蛋白是一种新型棕榈酰蛋白 delta-9 去饱和酶，对游离脂肪酸（特别是棕榈酸）具有低亲和力，而对棕榈酰化蛋白具有高亲和力。Cln3缺陷小鼠的胰腺和脑组织中缺乏这种特定的酶活性，并且在培养的人神经母细胞瘤细胞中被 siRNA 抑制完全消除。研究结果表明CLN3蛋白在膜相关蛋白脂质修饰中发挥作用。纳拉扬等人(2006)提出，这种酶活性的缺陷会导致细胞内蛋白脂质积累、神经元细胞死亡和巴顿病特征的神经变性。

Hobert 和 Dawson (2007)从对照和 JNCL 大脑中分离出耐清洁剂的膜，发现 JNCL 衍生的膜比对照的浮力更小。磷脂含量分析显示，JNCL 来源的膜和 JNCL 脑中的总脂质中的双（单酰基甘油）磷酸酯 (BMP) 减少。代谢标记表明 JNCL 成纤维细胞中 BMP 的合成减少，但在与野生型CLN3互补后恢复。野生型CLN3的过度表达也增加了 BMP 的合成。Hobert 和 Dawson (2007)得出结论，CLN3在 BMP 生物合成和维持耐去污剂膜的脂质谱中发挥作用。

Chang 等人在 SH-SY5Y 人神经母细胞瘤细胞系中使用酵母 2-杂交分析、体外蛋白质下拉测定和内源蛋白质共免疫沉淀(2007)表明钙老素 (KCNIP3; 604662 ) 与CLN3的 C 末端相互作用。全长CLN3或分离的CLN3 C 末端的过表达抑制了药理学上升高的细胞内 Ca(2+) 浓度引发的细胞死亡。相反，通过反义 cDNA 敲低CLN3会增加细胞对高 Ca(2+) 触发的细胞死亡的敏感性。Ca(2+)在体外降低了calsenilin与CLN3之间的相互作用，敲低calsenilin使SH-SY5Y细胞对Ca(2+)诱导的细胞死亡不敏感。张等人(2007)得出结论，CLN3调节钙老素介导的神经细胞死亡。

塔克斯沃斯等人(2009)在果蝇中开发了遗传功能获得系统，以确定CLN3的功能途径和相互作用。他们确定了CLN3与 Notch (NOTCH1; 190198 ) 和 Jun (MAPK8; 601158 ) N 端激酶信号通路之间的相互作用，并描述了 RNA 剪接和定位机制在调节CLN3功能中的潜在作用。

维蒂洛等人(2010)证明CLN3与 SBDS ( 607444 ) 相互作用，SBDS 是 Shwachman-Bodian-Diamond 综合征 ( 260400 ) 患者中突变的蛋白质。Btn1 和 Sdo1（ CLN3和 SBDS各自的酿酒酵母直系同源物）之间的蛋白质-蛋白质相互作用是保守的。研究表明，BTN1 的缺失会导致液泡 pH 值和液泡 (H+)-ATP 酶 (V-ATP 酶) 依赖性 H+ 转运和 ATP 水解的改变。维蒂洛等人(2010)发现 Sdo1 缺失菌株降低了液泡 pH 值以及 V-ATP 酶依赖性 H+ 转运和 ATP 水解；这种改变是由于 V-ATP 酶亚基表达减少所致。Btn1 的过度表达或离子载体羰基氰化物间氯苯腙 (CCCP) 的存在会导致缺乏 Sdo1 的酵母生长减少。在正常细胞中，Btn1 的过度表达反映了 CCCP 的作用，由于 V-ATP 酶依赖性 H+ 转运和 ATP 水解耦合的改变，两者都会导致液泡 pH 值升高。作者提出 Sdo1 和 SBDS 分别调节 Btn1 和CLN3。

在肿瘤发生中的作用

幼年巴顿病是一种神经退行性疾病，由CLN3 基因缺陷导致的光感受器和神经元加速凋亡引起。当在 NT2 神经元前体细胞中过表达时，CLN3具有抗凋亡作用。由于细胞凋亡调节的缺陷与癌症的发展有关，Rylova 等人(2002)评估了多种癌细胞系和实体结肠癌组织中CLN3在 mRNA 和蛋白质水平上的表达。他们发现CLN3 mRNA 和蛋白质在多种人类癌细胞系中过度表达。它在小鼠黑色素瘤和乳腺癌细胞系中也上调。他们发现 10 个实体结肠肿瘤中有 8 个的CLN3表达比相应的结肠对照组织高 22% 至 330%。使用表达腺病毒的反义CLN3阻断CLN3 表达可抑制癌细胞的生长和活力。它还通过从头合成神经酰胺导致内源性神经酰胺产量增加，并导致细胞凋亡增加。这表明反义CLN3可能是某些癌症的治疗选择。更重要的是，这些结果表明CLN3是癌症药物发现的新分子靶标。

▼ 分子遗传学

国际巴顿病联盟 (1995)证明，根据 56 个单倍型鉴定，导致 73% 巴顿病 ( CLN3 ; 204200 ) 染色体的突变是CLN3基因中1.02 kb ( 607042.0001 ) 的基因组缺失。

门罗等人(1997)在 188 名不相关的 Batten 病患者中，有 139 名 (74%)发现了常见的 1.02-kb CLN3缺失的纯合性；41 人是缺失和另一个CLN3突变的复合杂合子。通过 SSCP 分析和直接测序，Munroe 等人(1997)在CLN3基因中发现了19个新突变：6个错义突变、5个无义突变、3个小缺失、3个小插入、1个内含子突变和1个剪接位点突变。该报告使CLN3中已知的与疾病相关的突变总数达到 23 个。所有预测会产生截短蛋白的突变纯合子的患者都被发现患有典型的青少年发病的CLN3。然而，4 名错义突变和 1.02 kb 缺失的复合杂合子患者被发现表现出非典型表型，主要是视力障碍，而不是严重的神经退行性变。发现所有错义突变都会影响不同物种中人类蛋白质和同源物之间保守的残基。

劳罗宁等人(1999)提出了 10 种不同的芬兰复合杂合子的表型，这些杂合子具有常见的 1.02-kb 缺失 ( 607042.0001 ) 和另一条染色体上5 个罕见CLN3突变中的一个。他们在 3 个家庭（总共 6 名患者）中发现了一种新的突变，导致外显子 10 至 13 缺失。该突变与607042.0002中描述的突变不同，它保留了标记 D16S298。

摩尔等人(1999)列出了在各种 CLN 中发现的突变；他们报告了与CLN3相关的 25 个突变和 2 个多态性。

佩尔绍德-萨温等人(2002)证明，常见 1.02-kb 缺失 ( 607042.0001 ) 纯合的CLN3缺陷型淋巴母细胞永生化生长速度较慢，并且对依托泊苷诱导的细胞凋亡的敏感性增加，支持CLN3可能负向调节细胞凋亡的观点。使用包含外显子 11 或 13 的突变CLN3 cDNA转染 JNCL 淋巴母细胞后，对依托泊苷诱导的细胞凋亡的保护作用很明显，并且细胞生长率恢复。糖基化位点 71-74 和 310-313 的删除以及高度保守的突变氨基酸序列 184-195、291-295 或 330-337 会导致生长减慢并容易发生细胞凋亡。

▼ 基因型/表型相关性

哈斯克尔等人(2000)检查了自然发生的点突变对CLN3 细胞内定位的影响、它们补充CLN3缺陷的酵母 btn1-delta 的能力，以及被认为参与CLN3运输的推定法呢基化基序。研究的所有 6 种错义突变（如野生型CLN3 ）与非神经元细胞中的溶酶体相关膜蛋白 II ( 309060 ) 以及神经元细胞系中的突触素 ( 313475 )高度相关。在酵母功能测定中，与轻度表型相关的点突变也表现出CLN3活性，而与严重疾病相关的突变未能完全恢复CLN3功能。法尼基化基序发生突变的CLN3运输正常，但功能受损。作者得出的结论是，导致巴顿病的点突变不会影响蛋白质运输，而是通过损害蛋白质功能来发挥作用。

▼ 动物模型

科特曼等人(2002)将常见的 1-kb 基因组 DNA 缺失引入小鼠CLN3同源物中，以创建Cln3 (ex7/8) 敲入小鼠。该等位基因产生选择性剪接的 mRNA，包括预测非截短蛋白质的变体，以及在外周和中枢神经系统细胞的细胞质中检测到的突变 battenin。此外，Cln3 (ex7/8) 纯合子从出生前就表现出 JNCL 样膜沉积物的积累，与巴滕宁水平成比例，巴滕宁水平在肝脏和选定的神经元群体中很高。尽管肝酶和中枢神经系统发育正常，但Cln3 (ex7/8) 小鼠在视网膜、大脑皮层和小脑中表现出隐性遗传的退行性变化，以及神经功能缺陷和过早死亡。作者得出的结论是，常见 JNCL 突变对 CNS 的有害影响与膜沉积本身并没有很好的相关性，这表明特定的 battenin 活性对于 CNS 神经元的生存至关重要。

在纯合Cln3 (ex7/8) 小鼠的大脑中， Cao 等人(2006)发现自噬标记物Lc3 II的上调(参见601242 )和自噬抑制剂Mtor的下调(FRAP1；601231 )。来自纯合Cln3 (ex7/8) 小鼠的分离自噬液泡和溶酶体的超微结构形态比野生型细胞器成熟度较低，并且线粒体 ATP 酶亚基 c（参见 ATP5G1；603192）在自噬液泡中积累，与 JNCL 中看到的相似。曹等人(2006)还观察到正常衰老小鼠自噬液泡中线粒体 ATP 酶亚基 c 的积累。从Cln3 (ex7/8) 小脑细胞中分离出的 Lc3 阳性囊泡在自噬刺激后表现出运输改变和内吞囊泡和溶酶体囊泡融合减少。刺激自噬不会显着影响纯合Cln3 (ex7/8) 细胞的细胞存活，但抑制自噬会导致细胞死亡。曹等人(2006)的结论是，JNCL 中的自噬可能在自噬液泡成熟水平上受到破坏，他们提出自噬的激活可能是疾病过程中的一种促生存反馈反应。

▼ 等位基因变异体（ 7 选例）：

.0001 Ceroid 脂褐质沉积症，神经元，3
CLN3，1.02KB删除
国际巴顿病联盟 (1995)证明，由 56 个单倍型确定的导致 73% 巴顿病 ( CLN3 ; 204200 ) 染色体的突变是 1.02 kb 的基因组缺失，包括 217 bp 的开放阅读框（核苷酸 598） -814)，对应2个外显子。删除这 217 bp 的编码序列会产生移码，在删除连接点下游 84 bp 处生成 TAA 终止密码子。预测的翻译产物是一个由 181 个氨基酸组成的截短蛋白质，由该蛋白质的前 153 个残基组成，随后是终止密码子之前的 28 个新氨基酸。

在芬兰，90% 的 Batten 病患者携带 1.02 kb 缺失。贾维拉等人(1996)开发了一种快速诊断固相小测序测试来检测这种缺失。

这种纯合形式的 1.02-kb 缺失总是会导致严重的表型，包括失明、癫痫、痴呆和大约 24 岁时过早死亡（Munroe 等，1997；Jarvela 等，1997）。

基茨穆勒等人(2008)证明常见的 1.02-kb 删除保留了残余功能。两个突变的CLN3转录物存在于突变纯合的患者细胞中：主要转录物编码了编码残基 1 至 153 的截短蛋白质，后跟 28 个额外的氨基酸，次要转录物编码了将外显子 6 剪接到外显子 10 并恢复了外显子 10 后的阅读框。当使用 RNA 沉默来消除患者细胞中的这些转录物时，溶酶体的大小显着增加，证实了该蛋白质具有功能。突变型CLN3转录物的过度表达始终导致溶酶体尺寸减小。对小鼠细胞模型和酵母的研究证实，相应的突变转录本保留了显着的功能。大部分 1.02-kb 缺失的突变CLN3蛋白保留在内质网内。基茨穆勒等人(2008)得出结论，常见的突变型CLN3蛋白保留了显着的功能，并且 JNCL 是一种突变特异性疾病表型。残余功能可能解释了为什么与其他形式的 CLN 相比，这种形式的 CLN 发病较晚且临床表现较轻。

.0002 Ceroid 脂褐质沉积症，神经元，3
CLN3、3 -KB 删除、NT928
在一名患有巴顿病 ( 204200 ) 的芬兰患者中，国际巴顿病联盟 (1995)鉴定出CLN3基因中 2 个缺失的复合杂合性：1.02 kb 缺失 ( 607042.0001 ) 和导致 266 bp 的 3 kb 缺失编码序列缺失（核苷酸 928-1193），导致截短的蛋白质具有CLN3的前 263 个氨基酸，随后在终止密码子之前有 28 个新氨基酸。

.0003 Ceroid 脂褐质沉积症，神经元，3
CLN3 , 6-KB 删除
Taschner 等人在一位患有巴顿病 ( 204200 )的摩洛哥裔患者中(1995)证明了CLN3基因缺失的纯合性。国际 Batten 疾病联盟 (1995)报告称，该患者有 6 kb 的缺失。

.0004 Ceroid 脂褐质沉积症，神经元，3
CLN3、IVSDS、GC、+1/76-BP DEL
国际巴顿病联盟 (1995)描述了一位患有巴顿病 ( 204200 ) 的芬兰患者 L198Pa，他是一条“56 号染色体”( 607042.0001 ) 和一条“76 号染色体”(D16S988/D16S298) 的复合杂合子。他们发现了对应于 cDNA 碱基 598-670 的 73 bp 外显子的缺失。核苷酸序列分析显示外显子后剪接供体位点+1处发生G-C颠换。父亲是该突变的杂合携带者。患者的出生和幼儿期都很顺利。7 岁时开始进行性视力衰竭。9 岁时，她的 MRI 显示异常。反复观察到空泡淋巴细胞，直肠活检标本的电子显微镜显示巴顿病典型的包涵体。她在 9 岁时接受了丙戊酸钠治疗，当时她经历了唯一一次癫痫发作。13岁时再次检查显示运动功能良好，但智力下降相对较快。

.0005 Ceroid 脂褐质沉着症，神经元，3，长期
CLN3 ,GLU295LYS
Wisniewski 等人在 2 名患有罕见、迁延性青少年发病神经元蜡样质脂褐质沉积症 ( CLN3 ; 204200 ) 的同胞中(1998)鉴定了CLN3基因中 2 个突变的复合杂合性：1.02-kb 缺失 ( 607042.0001 ) 和 1020G-A 转变，导致 glu295-to-lys (E295K) 取代。两个兄弟姐妹均在 5 岁时发病，但姐姐活到了 51 岁，哥哥仍然活到 39 岁。

.0006 Ceroid 脂褐质沉着症，神经元，3，长期
CLN3 , TYR199TER
Sarpong 等人在 5 名同胞中，由近亲黎巴嫩父母所生，患有长期型青少年发病的神经元蜡样脂褐质沉着症 ( CLN3；204200 ) (2009)鉴定了CLN3基因外显子 8 中的纯合 597C-A 颠换，导致 tyr199-to-ter (Y199X) 取代并丢失 239 个 C 末端氨基酸。RT-PCR 分析检测到突变转录本，表明它没有被无义介导的 mRNA 衰减所降解。Y199X 突变在父母和 4 个同胞中的杂合性中被发现，但在 200 个对照等位基因中没有发现。在这个家庭中，这种疾病在 4 至 5 岁时发病，受影响的孩子变得沉默、寡言和易怒。视力丧失发生在 6 到 9 年间，癫痫发生在 10 到 15 年间，不久之后就隐秘地出现了运动障碍。然而，所有人都能够独立行走直到 20 岁。病理学研究证实了诊断。

.0007 Ceroid 脂褐质沉着症，神经元，3，长期
CLN3 ,GLY165GLU
Cortese 等人在 2 名成年意大利兄弟中发现，他们的父母是近亲，患有长期型青少年发病的神经元蜡样脂褐质沉着症 ( CLN3；204200 ) (2014)鉴定了CLN3基因中的纯合 c.494G-A 转变，导致第二个管腔环中高度保守的残基处发生 gly165-to-glu (G165E) 取代。该突变是通过外显子组测序发现并通过桑格测序确认的，并根据 SNP 数据库进行筛选。未受影响的母亲是该突变的杂合子；父亲去世了。没有对该变体进行功能研究。两名患者在儿童时期均出现视力丧失，但没有其他神经系统异常。在后来的生活中，他们都患上了肥厚性心肌病、癫痫发作和非常轻微的认知障碍。肌肉活检显示大的自噬泡和自体荧光物质。