NANOG 同源基因; NANOG

同源基因转录因子NANOG
FLJ12581

HGNC 批准的基因符号：NANOG

细胞遗传学定位：12p13.31 基因组坐标（GRCh38）：12:7,789,402-7,799,146（来自 NCBI）

▼ 克隆与表达

源自囊胚内细胞团（ICM）的胚胎干（ES）细胞可以无限生长，同时保持多能性。Lif（159540）可以通过激活Stat3（102582）来维持小鼠ES细胞的自我更新，但对于ICM和人ES细胞的维持是可有可无的。为了寻找 ICM 和 ES 细胞多能性的关键因素，Mitsui 等人（2003）进行了计算机差异显示，并鉴定了在小鼠 ES 细胞和植入前胚胎中特异性表达的几个基因。其中一个编码一种同源蛋白，作者将其命名为 Nanog（来自“Tir Na Nog”，凯尔特神话中的长生不老之地），能够孤立于 Lif/Stat3 维持 ES 细胞的自我更新。Nanog cDNA 包含一个编码 305 个氨基酸多肽的开放阅读码组，并具有一个包含 B2 重复元件的长 3 素非翻译区。预测的Nanog蛋白含有与Nk2基因家族最相似的同源基因结构域（见606727）。人Nanog蛋白（FLJ12581）与小鼠蛋白总体氨基酸一致性为52%，同源结构域一致性为85%。人类和小鼠 Nanog 均含有富含 trp 的重复序列，其中 trp-xxx 分别重复 8 次和 10 次。人类 Nanog 在 3 素非翻译区含有 Alu 重复元件。EST 数据库搜索在 NT2 人畸胎癌细胞、生殖细胞和睾丸肿瘤、骨髓和其他肿瘤的文库中鉴定出与人 Nanog 相对应的克隆。在正常体细胞组织的文库中未检测到 EST 克隆。

Chambers et al.（2003）孤立地在小鼠ES细胞中应用表达克隆来分离自我更新决定簇，并获得了编码Nanog的cDNA。通过搜索序列数据库，他们鉴定了 Nanog 的人类和大鼠直系同源物。人类NANOG蛋白含有305个氨基酸。

Clark等人（2004）通过对人睾丸和胚胎干细胞cDNA文库进行PCR，获得了编码NANOG的全长cDNA。人体组织的 Northern 印迹分析仅在成人睾丸中检测到 2.2 kb 转录物的弱表达。RT-PCR 在成人睾丸、成人和胎儿卵巢中检测到 NANOG 表达，但在纯支持细胞综合征男性的睾丸中未检测到 NANOG 表达（参见 400042）。与正常睾丸相比，实时 PCR 检测到精原细胞瘤中 NANOG 的表达要高得多。NANOG由未分化培养的人胚胎干细胞表达，并且表达随着分化的进行而降低。

Hart et al.（2004）鉴定了小鼠 Nanog 的 3 个剪接变体。最长的变体编码 305 个氨基酸的蛋白质，两个较短的变体编码 279 个氨基酸的蛋白质。RT-PCR检测未分化的小鼠ES细胞和胚胎癌细胞中Nanog的表达。在植入前胚胎中，在桑椹胚和囊胚中检测到表达。植入后表达存在，但在胚胎第 8.5 天后下调。在许多成年小鼠组织中检测到低水平的 Nanog。原位杂交显示 Nanog 局限于小鼠囊胚的内细胞团。当外胚层细胞进入原条并经历上皮间质转化时，表达下调。晚芽阶段后，Nanog 的表达减弱，到第 8 天时检测不到。在发育中的性腺中，Nanog 的表达在胚胎第 11.5 天检测到。

▼ 基因功能

Mitsui et al.（2003）表明，Nanog缺陷型ICM不能产生外胚层，只产生壁层内胚层样细胞。Nanog缺陷的ES细胞失去多能性并分化为胚外内胚层谱系。这些数据表明 Nanog 是 ICM 和 ES 细胞多能性的关键因素。

Chambers et al.（2003）确定Nanog指导未分化ES细胞的增殖。Nanog mRNA 存在于多能小鼠和人类细胞系中，但在分化细胞中不存在。在植入前胚胎中，Nanog 仅限于可衍生 ES 细胞的创始细胞。研究发现内源性 Nanog 与 Stat3 的细胞因子刺激同时发挥作用，驱动 ES 细胞自我更新。转基因构建体的 Nanog 表达升高足以进行 ES 细胞的克隆扩增，绕过 Stat3 并维持 Oct4（164177）水平。转基因切除后，细胞因子依赖性、多谱系分化和胚胎定植能力完全恢复。这些发现确立了 Nanog 在定义 ES 细胞身份的转录因子层次结构中的核心作用。

Silva et al.（2006）报道，在ES细胞和神经干（NS）细胞之间的融合中，Nanog水平的增加刺激了体细胞基因组的多能基因激活，并使杂交集落的恢复率提高了200倍，所有这些都显示出ES细胞的特征。当胸腺细胞或成纤维细胞与 ES 细胞融合时，Nanog 还提高了杂交产量。然而，与 ES x NS 细胞融合相比，获得的集落较少，这与体细胞类型之间对重编程的分级敏感性一致。值得注意的是，对于 NS x ES 细胞融合，Nanog 的升高使原代杂交体能够发育成与同型 ES x ES 融合产物相同频率的 ES 细胞集落。这意味着在杂交体中，Nanog 的增加足以使 NS 细胞表观基因组完全重置为多能性状态。Silva等人（2006）得出结论，Nanog可以协调ES细胞机制以实现多能性，其效率高达100%，具体取决于体细胞的分化状态。

Wang et al.（2006）探索了Nanog在小鼠ES细胞中运作的蛋白质网络。Wang et al.（2006）利用自然条件下的 Nanog 亲和纯化和质谱分析鉴定了物理相关的蛋白质。他们还以迭代的方式鉴定了几种 Nanog 相关蛋白（包括 Oct4）的伴侣，验证了所选新鉴定成分的功能相关性，并构建了蛋白质相互作用网络。该网络高度富集核因子，这些核因子对于维持 ES 蜂窝状态和分化的共同调节至关重要。该网络与多个辅抑制通路相连，由许多蛋白质组成，这些蛋白质的编码基因是其成员的推定直接转录靶标。Wang et al.（2006）得出的结论是，这种紧密的蛋白质网络似乎起到了专用于多能性的细胞模块的作用。Wang et al.（2006）在几种不同的测定中证实了 Nanog 与 Dax1（300473）、Nac1（610672）、Zfp281 和 Oct4 的相互作用。

Pereira et al.（2006）表明Tcf3（604652）限制了自我更新的小鼠ES细胞中Nanog mRNA、蛋白质和启动子活性的稳态水平。染色质免疫沉淀和启动子报告基因检测表明，Tcf3 与 Nanog 基因的启动子调控区结合并抑制其转录活性。Tcf3的缺失使Nanog水平在胚状体形成过程中持续升高5天，从而延迟ES细胞的体外分化。Pereira et al.（2006）得出结论，TCF3介导的NANOG表达控制使得ES细胞能够平衡谱系定向细胞和未分化细胞的产生。

通过逆转录病毒介导引入4个转录因子并随后选择Fbx15（609093）表达，可以从小鼠成纤维细胞中产生诱导多能干（iPS）细胞（Takahashi and Yamanaka, 2006）。这些iPS细胞，以下称为Fbx15 iPS细胞，在形态、增殖和畸胎瘤形成方面与胚胎干（ES）细胞相似；然而，它们在基因表达和DNA甲基化模式方面有所不同，并且无法产生成年嵌合体。Okita 等人（2007）表明，与 Fbx15 iPS 细胞相比，Nanog 表达的选择导致具有种系活性的 iPS 细胞具有增加的 ES 细胞样基因表达和 DNA 甲基化模式。4个转基因Oct3/4（164177）、Sox2（184429）、c-Myc（190080）和Klf4（602253）在Nanog iPS细胞中被强烈沉默。Okita等人（2007）从7个Nanog iPS细胞克隆中获得了成体嵌合体，其中一个克隆通过种系传递给下一代。大约 20% 的后代因 c-Myc 转基因的重新激活而出现肿瘤。Okita et al.（2007）得出结论，可以从成纤维细胞中获得具有生殖系嵌合体能力的iPS细胞，但在临床应用中应避免通过逆转录病毒引入c-Myc。

Wernig et al.（2007）孤立证明转录因子Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4可以诱导体细胞基因组表观遗传重编程至胚胎多能状态。与Fbx15激活的选择相反（Takahashi and Yamanaka, 2006），重新激活内源性Oct4（Oct4-neo）或Nanog（Nanog-neo）位点的成纤维细胞孤立于饲养细胞生长，表达正常的Oct4、Nanog和Sox2 RNA，并且蛋白质水平，根据许多标准在表观遗传学上与 ES 细胞相同，并且能够产生可行的嵌合体，有助于种​​系，并在注射到四倍体囊胚后产生可行的妊娠晚期胚胎。转导 4 个因子后，Nanog-neo 产生的耐药细胞明显多于 Oct4-neo 成纤维细胞，但较高比例的 Oct4-选择细胞具有多能 ES 细胞的所有特征，这表明 Nanog 激活是一个不太严格的标准多能性高于 Oct4 激活。

Chambers et al.（2007）报道Nanog在胚胎干细胞中发生波动。Nanog 的瞬时下调似乎使细胞易于分化，但并不标志着细胞分化。通过基因删除，作者表明，尽管胚胎干细胞易于分化，但在 Nanog 永久缺失的情况下，它们可以无限期地自我更新。扩增的 Nanog-null 细胞定植于胚胎胚层，并在胎儿和成年嵌合体中表现出多谱系分化。尽管它们也被招募到生殖系，但缺乏 Nanog 的原始生殖细胞在到达生殖嵴时未能成熟。通过修复突变等位基因可以挽救这一缺陷。因此，Chambers et al.（2007）得出结论，Nanog对于体细胞多能性的表达是可有可无的，但对于生殖细胞的形成是特别需要的。因此，Nanog 主要作用于内细胞团和生殖蜂窝状态的构建，而不是多能性的管家机制。Chambers et al.（2007）推测Nanog通过抵抗或逆转替代基因表达状态来稳定培养中的胚胎干细胞。

Yu et al.（2007）表明OCT4（164177）、SOX2（184429）、NANOG和LIN28（611043）这4个因子足以将人类体细胞重编程为具有胚胎干细胞基本特征的多能干细胞。这些诱导多能人类干细胞具有正常核型，表达端粒酶活性，表达表征人类ES细胞的细胞表面标记和基因，并保持分化为所有3个初级胚层的高级衍生物的发育潜力。

Tay et al.（2008）证明了在小鼠 Nanog、Oct4 和 Sox2 基因的氨基酸编码序列中存在许多天然存在的 miRNA 靶标。一些分析的 miRNA 靶标不包含 miRNA 种子，而其他靶标则跨越外显子-外显子连接，或者在人类和恒河猴基因组中不保守。miRNA134（610164）、miRNA296（610945）和miRNA470在视黄酸诱导的小鼠胚胎干细胞分化中上调，以各种组合靶向每个转录因子的编码序列，导致分化小鼠特有的转录和形态学变化。胚胎干细胞，并产生新的表型。预测靶点的沉默突变消除了 miRNA 活性，阻止了相应基因的下调，并延迟了诱导的表型。Tay et al.（2008）得出的结论是，他们的发现证明了编码序列定位的 miRNA 靶点的丰富性，其中一些可能是物种特异性的，并支持了一种增强模型，即动物 miRNA 通过可以存在于外部的靶点对 mRNA 进行控制。 3素数非翻译区域。

Hanna等人（2009）证明，Oct4、Sox2、Klf4和Myc转录因子将体细胞重编程为iPS细胞是一个连续的随机过程，几乎所有小鼠供体细胞在持续生长和发育过程中最终都会产生iPS细胞。转录因子表达。额外抑制 p53（191170）/p21（116899）途径或过表达 Lin28 会增加细胞分裂速率，并导致 iPS 细胞形成动力学加速，与细胞增殖的增加成正比。相比之下，Nanog 过度表达以主要与细胞分裂速率无关的方式加速重编程。定量分析定义了不同的细胞分裂速率依赖和孤立模式，以加速重编程的随机过程，并表明细胞分裂的数量是驱动表观遗传重编程多能性的关键参数。

iPS细胞的生成异步且缓慢，频率低（小于0.1%），DNA去甲基化构成瓶颈。为了确定重编程中涉及的调控机制，Bhutani et al.（2010）生成了种间异核体（融合胚胎干细胞和人类成纤维细胞），同步、频繁、快速地诱导重编程。Bhutani et al.（2010）表明，单异核体的多能性重编程无需细胞分裂或DNA复制即可启动，快速（1天）且高效（70%）。短干扰RNA介导的敲低表明AID（605257）是启动子去甲基化和诱导OCT4和NANOG基因表达所必需的。AID 蛋白结合成纤维细胞中的沉默甲基化 OCT4 和 NANOG 启动子，但不结合 ES 细胞中的活性去甲基化启动子。Bhutani 等人（2010）得出的结论是，他们的数据提供了第一个证据，证明哺乳动物 AID 是人类体细胞中主动 DNA 去甲基化和启动核重编程以实现多能性所必需的。

Kunarso等人（2010）利用染色质免疫沉淀测序（ChIP-Seq）表明，CTCF（604167）结合的基因组区域在未分化的小鼠胚胎干细胞和人胚胎干细胞之间高度保守。然而，OCT4 和 NANOG 结合区域的保守性却很少。物种之间 OCT4 和 NANOG 结合的大部分差异似乎是由于转座元件的物种特异性插入，例如内源 ERV1 重复序列，它产生了独特的 OCT4 和 NANOG 重复序列相关的结合位点。

Miyanari and Torres-Padilla（2012）表明，Nanog（而非 Oct4）在早期植入前小鼠胚胎中单等位表达。然后，在晚期囊胚的幼稚外胚层向基态多能性转变期间，Nanog 逐渐转变为双等位基因表达。白血病抑制因子（LIF；LIF）中生长的胚胎干（ES）细胞 159540）和血清主要以单等位基因表达 Nanog，并显示 Nanog 基因座的异步复制，这是单等位基因表达基因的一个特征，但 ES 细胞在 2i 条件下培养时激活两个等位基因，模拟体外多能基态。报告 ES 细胞的活细胞成像证实了 Nanog 的等位基因表达并揭示了等位基因转换。Nanog的等位基因表达受到成纤维细胞生长因子（FGF）-细胞外信号调节激酶（ERK）信号通路的调节，伴随着近端启动子处的染色质变化，但与DNA甲基化无关。Nanog杂合囊胚具有较少的内细胞团衍生物和延迟的原始内胚层形成，表明Nanog的双等位基因表达在内细胞团及时成熟为完全重编程的多能外胚层中的作用。Miyanari和Torres-Padilla（2012）提出，在细胞水平上严格调节Nanog剂量对于发育过程中获得基态多能性是必要的。作者得出的结论是，他们的数据强调了等位基因表达在控制体内多能性因子剂量方面的意想不到的作用，为重编程的调节增加了额外的水平。

Doege等人（2012）描述了体细胞重编程的早期和关键阶段，在内源多能性基因座（例如NANOG和ESRRB（602167））转录诱导之前。转导多能因子 OCT4（164177）、SOX2（184429）、KLF4（602253）和 MYC（190080）（统称为 OSKM）后第 4 天，iPSC 生成所需的 2 个表观遗传修饰因子，即 PARP1（173870） ）和 TET2（612839），被招募到 NANOG 和 ESRRB 基因座。这些表观遗传修饰因子似乎在体细胞重编程过程中早期表观遗传标记的建立中具有互补作用：PARP1在5-甲基胞嘧啶（5mC）修饰的调节中发挥作用，而TET2对于5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）的早期生成至关重要。 5mC氧化。尽管 5hmC 被认为在某些情况下主要作为 5mC 去甲基化为胞嘧啶的中间体，但 Doege 等人（2012）得出的结论是，他们的数据以及 TET2 突变人类肿瘤细胞的研究都支持 5mC 的作用。 5hmC 作为与 5mC 不同的表观遗传标记。与此一致的是，PARP1 和 TET2 都是早期建立组蛋白修饰所必需的，这些修饰代表多能性位点处激活的染色质状态，而 PARP1 诱导进一步促进了 OCT4 重编程因子的可及性。Doege et al.（2012）得出的结论是，他们的发现表明 PARP1 和 TET2 有助于表观遗传程序，在体细胞重编程过程中指导多能位点的后续转录诱导。

利用增强的纯化技术和严格的计算算法，Costa等人（2013）在小鼠胚胎干细胞中鉴定出了Nanog的27个高可信度蛋白质相互作用伙伴。这些由Nanog的19个伙伴组成，其中包括10-11易位（TET）家族甲基胞嘧啶羟化酶Tet1（607790）。Costa等人（2013）证实了Nanog与Tet1的物理关联，并证明Tet1与Nanog协同作用，提高了重编程的效率。Costa等人（2013）也发现了Tet2与Nanog的物理关联和重编程协同作用，并证明Tet2的敲除消除了Nanog与Tet1催化缺陷突变体的重编程协同作用。这些结果表明 Nanog 和 Tet1/Tet2 蛋白之间的物理相互作用以依赖于 Tet1/Tet2 催化活性的方式促进重编程。Tet1 和 Nanog 共同占据与胚胎干细胞中多能性维持和谱系定型相关的基因的基因组位点，并且当 Nanog 耗尽时，Tet1 结合会减少。Nanog 和 Tet1 的共表达增加了排名靠前的共同靶基因座 Esrrb 和 Oct4 的 5-羟甲基胞嘧啶水平，导致它们在重编程为初始多能性之前启动表达。Costa等人（2013）提出NANOG招募TET1来增强关键重编程靶基因子集的表达。

受精后，母体因素指导发育并在母体向合子转变时触发合子基因组激活（ZGA）。在斑马鱼中，ZGA 是原肠胚形成和母体 mRNA 清除所必需的，这部分受到保守的 microRNA miR430（与人 MIR302A, 614596 同源）的调节。Lee等（2013）表明Nanog、Pou5f1（164177）和SoxB1调节斑马鱼的合子基因激活。Lee等人（2013）鉴定了数百个由母体因素直接激活的基因，构成了第一波合子转录。核糖体分析显示，Nanog、Sox19B（SoxB1 家族成员）和 Pou5f1 是母体向合子转变之前翻译程度最高的转录因子。这些因素的综合丧失导致原肠胚形成前发育停滞，并且无法激活超过 75% 的合子基因，包括 miR430。Lee et al.（2013）得出结论，母体Nanog、Pou5f1和SoxB1是启动合子发育程序所必需的，并通过激活miR430表达来诱导母体程序的清除。

De Wit et al.（2013）将染色质构象捕获技术与染色质因子结合数据相结合，证明非活性染色质在多能干细胞核中异常混乱。他们表明，基因启动子以很大程度上孤立于组织的方式参与拓扑结构域之间的接触，而增强子则具有更多组织限制的相互作用。值得注意的是，多能因子结合位点的基因组簇以严格多能干细胞特异性的方式非常有效地找到彼此，依赖于 Oct4（Pou5f1）和 Nanog 蛋白的存在，并且在人工招募 Nanog 到选定的区域后可诱导。染色体位点。De Wit et al.（2013）得出结论，多能干细胞具有由多能因子塑造的独特的高阶基因组结构，并推测这种相互作用组增强了多能状态的鲁棒性。

Murakami et al.（2016）在体外模型中研究了 Nanog 在小鼠单能原始生殖细胞中的作用，其中在碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和激活素 A 中培养的幼稚多能 ES 细胞发育为外胚层样细胞（ EpiLCs）并获得类似 PGC 的命运的能力。因此，骨形态发生蛋白-4（BMP4；112262），或关键种系转录因子 Prdm1（603423）、Prdm14（611781）和 Tfap2c（601602）的异位表达，直接在 EpiLC 中诱导 PGC 样细胞（PGCLC），但在 ES 细胞中则不然。Murakami et al.（2016）出乎意料地发现，单独使用 Nanog 可以孤立于 BMP4 在 EpiLC 中诱导 PGCLC，并提出在 EpiLC 建立过程中初始 ES 细胞多能性网络溶解后，表观基因组会针对细胞命运而重置决心。事实上，Murakami 等人（2016）发现 ES 细胞和 EpiLC 之间 Nanog 结合模式在全基因组范围内发生变化，表明调控元件的表观遗传重置。因此，作者表明 Nanog 可以在体外结合并激活 EpiLC 中的 Prdm1 和 Prdm14 增强子；Blimp1（由Prdm1编码）然后直接诱导Tfap2c。此外，虽然 Sox2 和 Nanog 促进 ES 细胞中的多能状态，但它们在 EpiLC 中表现出相反的作用，因为 Sox2 特异性抑制 Nanog 诱导的 PGCLC。Murakami等人（2016）的研究证明了细胞如何获得细胞命运决定能力的广泛适用的机制原理，从而导致关键转录因子在发育过程中发挥上下文依赖性作用。

▼ 基因结构

Hart et al.（2004）确定NANOG基因包含4个外显子，跨度7 kb。

Mitsui et al.（2003）确定小鼠Nanog基因含有4个外显子。Hart et al.（2004）在小鼠 Nanog 基因中鉴定出 2 个额外的上游外显子，用于选择性剪接转录本。

▼ 测绘

Mitsui et al.（2003）指出，人类Nanog基因定位到染色体12的一个区域，该区域与小鼠Nanog基因所在的染色体6具有同源性。

Clark等（2004）通过基因组序列分析，将NANOG基因定位到染色体12p13。Hart et al.（2004）在NANOG基因上游约100 kb处鉴定了一个重复的NANOG基因，他们将其称为NANOG2（NANOGP1）。这两个基因处于头尾相连的结构。Hart et al.（2004）还在染色体15q、7p、14q、2q、Xp和Xq上鉴定出了NANOG假基因。