RAD50 双链断裂修复蛋白； RAD50

RAD50，酿酒酵母，同源物

HGNC 批准的基因符号：RAD50

细胞遗传学位置：5q31.1 基因组坐标（GRCh38）：5:132,556,977-132,646,349（来自 NCBI）

▼ 克隆与表达

酿酒酵母 Rad50 基因编码一种蛋白质，该蛋白质对于通过非同源 DNA 末端连接和染色体整合进行双链 DNA 断裂修复至关重要。酵母 Rad50、Mre11（600814） 和 Xrs2 蛋白似乎在多蛋白复合物中发挥作用，这与这些基因的突变赋予几乎相同的无减数分裂重组表型和同源有丝分裂重组率升高的观察结果一致。通过直接从 5q23-q31 染色体区间选择 cDNA，Dolganov 等人（1996） 分离出编码人类 Rad50 同源物的 cDNA。人类 RAD50 基因的长度为 100 至 130 kb。Northern 印迹分析显示，RAD50 基因主要在睾丸中表达为 5.5 kb mRNA。还检测到了一个微弱的 7 kb 转录本，作者认为它是具有经过交替处理的 3 引物末端的 mRNA。酵母 Rad50 和预测的 1,312 个氨基酸的人类 RAD50 蛋白在 N 端和 C 端具有超过 50% 的同一性。蛋白质的中央七肽重复结构域具有相对不同的一级序列，但预计将采用非常相似的卷曲螺旋结构。Dolganov 等人使用免疫沉淀法（1996） 证明 153-kD RAD50 与蛋白质复合物中的 MRE11 稳定相关，该蛋白质复合物还可能包括 95 kD、200 kD 和 350 kD 的蛋白质。

▼ 测绘

通过包含在映射的克隆中并通过体细胞杂交体的分析，Dolganov 等人（1996） 将 RAD50 基因对应到染色体 5q31。他们认为重组DNA修复缺陷可能与髓系白血病的发展有关，因为该染色体区域在急性髓系白血病和骨髓增生异常性疾病中经常发生改变。

▼ 基因功能

特鲁希略等人（1998） 确定含有 RAD50 和 MRE11 的哺乳动物细胞核复合物中的 95-kD 蛋白质是 nibrin 或 p95（602667），这是由奈梅亨断裂综合征（NBS; 251260） 突变的基因编码的蛋白质。RAD50 复合物具有锰依赖性单链 DNA 核酸内切酶和 3-prime 至 5-prime 核酸外切酶活性。作者表示，这些核酸酶活性可能对重组、修复和基因组稳定性很重要。卡尼等人（1998） 证明 p95 是 MRE11/RAD50 复合体的一个组成部分，并且该复合体的功能在 NBS 患者的细胞中受损。他们表示，虽然 p95 与酵母 Xrs2 几乎没有序列同源性，但这两种蛋白可以被认为是功能类似物，因为它们将 MRE11/RAD50 的保守活性与其各自生物体中的细胞 DNA 损伤反应联系起来。

钟等人（1999） 表明 BRCA1（113705） 在体外和体内与 RAD50 相互作用。在携带 BRCA1 纯合突变的 HCC/1937 乳腺癌细胞中，辐射诱导的 BRCA1、RAD50、MRE11 或 p95 阳性灶的形成显着减少，但通过转染野生型 BRCA1 可以恢复。这些细胞中野生型（但未突变）BRCA1 的异位表达使它们对 DNA 损伤剂甲磺酸甲酯的敏感性降低。这些数据向作者表明，BRCA1 对于由 RAD50-MRE11-p95 复合物介导的细胞对 DNA 损伤的反应很重要。

王等人（2000） 使用免疫沉淀和质谱分析来鉴定 BRCA1 相关蛋白。他们发现 BRCA1 是肿瘤抑制因子、DNA 损伤传感器和信号传感器组成的大型多单元蛋白复合物的一部分。他们将这个复合体命名为 BASC，即“BRCA1 相关基因组监视复合体”。该复合物中鉴定的 DNA 修复蛋白包括 ATM（607585）、BLM（604610）、MSH2（609309）、MSH6（600678）、MLH1（120436）、RAD50-MRE11-NBS1 复合物和 RFC1（102579）- RFC2（600404）-RFC4（102577） 复合体。共聚焦显微镜证明 BRCA1、BLM 和 RAD50-MRE11-NBS1 复合物共定位于大核灶。王等人（2000） 提出 BASC 可以作为异常 DNA 结构的传感器和/或作为复制后修复过程的调节器。

端粒使细胞能够区分自然染色体末端和受损DNA，并保护末端免于降解和融合。在人类细胞中，端粒保护取决于 TTAGGG 重复结合因子 TRF2（602027），它可能会将端粒重塑为大的双链体环（t 环）。朱等人（2000）通过纳米电喷雾串联质谱法表明RAD50蛋白存在于TRF2免疫复合物中。免疫共沉淀研究表明，一小部分 RAD50、MRE11 和 p95 与 TRF2 相关。间接免疫荧光证明了间期端粒上存在 RAD50 和 MRE11。NBS1 在 S 期与 TRF2 和端粒相关，但在 G1 或 G2 期不相关。尽管 MRE11 复合物响应伽马射线在辐射诱导灶（IRIF） 中积累，但 TRF2 并未重新定位到 IRIF，并且辐射不会影响 TRF2 与 MRE11 复合物的关联，这反对 TRF2 在双链中的作用破损修复。朱等人（2000） 提出 MRE11 复合体在端粒上发挥作用，可能是通过调节 t 环的形成。

MRE11/RAD50 蛋白复合物在细胞对双链断裂（DSB） 反应的多个方面发挥作用，包括检测 DNA 损伤、激活细胞周期检查点和 DSB 修复。虽然酿酒酵母的遗传分析提供了有关这种高度保守复合物的 DSB 修复功能的见解，但人类复合物在奈梅亨断裂综合征中的含义揭示了其在细胞周期检查点功能中的作用。罗等人（1999） 建立了 Rad50 基因突变的小鼠，并检查了 Mre11/Rad50 蛋白复合物在 DNA 损伤反应中的作用。缺乏 Rad50 的早期胚胎细胞对电离辐射高度敏感，这与该复合物在电离辐射诱导的 DSB 修复中的作用一致。然而，Rad50 无效突变在培养的胚胎干细胞和早期发育的胚胎中是致命的，这表明哺乳动物蛋白复合物介导正常生长细胞中对于生存至关重要的功能。

在哺乳动物细胞中，MRE11、RAD50 和 NBS1（602667） 的保守多蛋白 MRN 复合物对于双链断裂修复、减数分裂重组和端粒维持非常重要。在缺乏早期区域 E4 的情况下，腺病毒的双链基因组会连接成太大而无法包装的串联体。斯特拉克等人（2002） 研究了参与多联体形成的细胞蛋白以及它们在野生型感染期间如何被 E4 产物灭活。他们证明，多联体化需要功能性的 MRE11 和 NBS1，并且这些蛋白质存在于病毒复制中心附近的病灶处。野生型病毒感染会导致 MRN 复合体成员重组和降解。这些活性由 3 种防止多联体化的病毒癌蛋白介导。这种对涉及基因组稳定性的细胞蛋白的靶向表明了在这些病毒癌蛋白中观察到的“打了就跑”转化的机制。

Franchitto 和 Pichierri（2002） 回顾了 RECQL2（604611） 和 RECQL3（604610） 在解决 DNA 复制停滞中的作用，以及它们与 MRN 复合物可能的相互作用。

钟等人（2005） 通过研究 RNA 干扰产生的 MRN 缺陷，测试了 MRN 复合物是否对 ATR（601215） 具有全局控制作用。MRN 复合物是 SMC1A（300040） 的 ATR 依赖性磷酸化所必需的，它在染色质内发挥作用，以确保姐妹染色单体的凝聚力并影响多种 DNA 损伤反应。由 MRN 缺陷引起的新表型支持该复合物、ATR 和 SMC1A 之间的功能联系，包括对紫外线暴露的超敏反应、有缺陷的紫外线响应内 S 期检查点以及基因组不稳定的特定模式。钟等人（2005） 得出的结论是，MRN 复合物对 ATR 激酶具有控制作用，并且这种控制下的下游事件很广泛，包括染色质相关信号因子和扩散信号因子。

阿布扎伊德等人（2009） 发现腺病毒介导的突变 RAD50 基因转染人鳞状细胞癌细胞会以显性失活的方式破坏 MRN 复合物。这种破坏显着下调了 MRN 表达，并增强了顺铂的体外细胞毒性，相应增加了 DNA 损伤和端粒缩短。用这种联合疗法治疗具有顺铂抗性人鳞状细胞癌异种移植物的裸鼠，导致肿瘤显着消退，肿瘤细胞凋亡增加。研究结果表明，在化疗耐药的情况下，使用靶向 RAD50 破坏可能是癌症治疗的一种化疗增敏方法。

斯台普斯等人（2016） 发现 MRNIP（617154） 耗尽的人类细胞表现出 DNA 损伤增加。免疫沉淀分析揭示了 MRNIP 与 MRN 复合物以及 ATM 的其他底物的相互作用。缺乏 MRNIP 的细胞会降低 MRN 功能，并出现 ATM 依赖性 DNA 损伤信号传导缺陷，以及对 DNA 断裂的反应受损。斯台普斯等人（2016） 得出的结论是，MRNIP 通过与 MRN 复合物相互作用，通过促进 MRN 复合物的染色质缔合以及随后的 ATM 信号级联激活，对 DNA 断裂做出强有力的细胞反应。

▼ 分子遗传学

Barbi 等人之前报道过一名患有染色体不稳定、X 射线过敏、小头畸形和生长迟缓（奈梅亨断裂综合征样疾病；NBSLD；613078）的患者（1991），沃尔特斯等人（2009） 鉴定了 RAD50 基因中的复合杂合性，即无义突变（604040.0001） 和导致 66 个氨基酸延伸的天然终止密码子突变（604040.0002）。没有检测到来自携带无义突变的等位基因的RNA或蛋白质，而从携带延伸突变的等位基因中可以检测到少量的RNA和蛋白质。与奈梅亨断裂综合征（604391） 和 MRE11 缺陷导致共济失调毛细血管扩张样疾病（604391） 的患者不同，这名 RAD50 缺陷患者没有免疫缺陷或恶性肿瘤。来自该患者的细胞的放射敏感性介于野生型和共济失调毛细血管扩张（208900） 细胞之间。

一名 15 岁女孩，由近亲土耳其父母所生，患有 NBSLD，Ragamin 等人（2020） 鉴定出 RAD50 基因（604040.0003） 中的纯合突变。该患者的皮肤成纤维细胞表现出抗辐射 DNA 合成，类似于共济失调毛细血管扩张症患者的成纤维细胞（208900）。在受辐射的患者成纤维细胞中，RAD50 蛋白几乎检测不到，并且其他 2 个 MRN 复合体成员 MRE11 和 NBN 也有所减少。此外，对患者成纤维细胞进行照射后，ATM 靶点 CHEK2（604373） 和 KAP1（TRIM28; 601742） 的磷酸化不存在。

▼ 生化特征

为了阐明 MRE11/RAD50 复合物在 DNA 双链断裂修复中的功能，Hopfner 等人（2001） 报道了 P. Furiosus Mre11 晶体结构，揭示了一个类似蛋白磷酸酶的二锰结合结构域，其顶部有一个控制活性位点访问的独特结构域。这些结构将 Mre11 的多种核酸酶活性统一在单一的内切/外切核酸酶机制中。绘制人类和酵母 MRE11 突变图谱揭示了真核大分子相互作用位点。此外，P. Furiosus Rad50 ABC-ATPase 及其相邻卷曲螺旋的结构定义了一个紧凑的 Mre11/Rad50-ATPase 复合物，并表明 RAD50-ATP 驱动的构象转换直接控制 MRE11 核酸外切酶。人类和 P. Furiosus MRE11/RAD50 复合物的电子显微镜、小角 X 射线散射和超速离心数据揭示了一种双功能复合物，由（MRE11）2/（RAD50）2 异四聚体 DNA 处理头和双卷曲组成-线圈连接器。

霍普夫纳等人（2002） 提出了 Rad50 卷曲螺旋区域的 2.2 埃晶体结构，揭示了卷曲螺旋顶点处的意外二聚体界面，其中成对的保守 cys-xx-cys 基序形成结合一个锌离子的互锁钩。生化、X 射线和电子显微镜数据表明，这些钩子可以连接相对突出的 Rad50 卷曲螺旋结构域，形成高达 1,200 埃的柔性桥。这表明 Rad50 ABC-ATPase 中的长插入具有功能。Rad50 钩子具有功能性，因为该基序的突变赋予酵母辐射敏感性，并破坏远处 Mre11（600814） 核酸酶界面的结合。霍普夫纳等人（2002） 得出的结论是，他们的数据支持 Rad50 卷绕线圈在 2 个 DNA 结合头之间形成金属介导的桥接复合物中的结构作用。所得组装体具有适当的长度和构象特性，可在同源重组中连接姐妹染色单体，在非同源末端连接中连接 DNA 末端。

人类 RAD50/MRE11/NBS1 复合物（R/M/N） 具有动态分子结构，由球状 DNA 结合结构域组成，其中突出有两个 50 纳米卷曲线圈。盘绕的线圈是柔性的并且它们的顶点可以自关联。盘绕线圈的灵活性使其顶点能够采用有利于相互作用的方向。然而，这也允许同一复合物内 2 个卷曲线圈的尖端之间发生相互作用，这与 DNA 束缚所需的复合物间相互作用竞争并受阻。莫雷诺-埃雷罗等人（2005） 表明 R/M/N 复合物的动态结构明显受到 DNA 结合的影响。R/M/N 球状结构域与 DNA 的结合导致卷曲线圈平行定向；这可以防止复合物内相互作用并有利于 DNA 束缚所需的复合物间关联。因此，R/M/N 复合物是生物纳米机器的一个例子，其中与其配体（在本例中为 DNA）的结合会影响位于 50 纳米之外的结构域的功能构象。

▼ 等位基因变异体（3 个精选示例）：

.0001 奈梅亨断裂综合征样疾病
RAD50，ARG1093TER

Barbi 等人之前报道过一名患有奈梅亨断裂综合征样疾病（NBSLD; 613078） 的患者（1991），沃尔特斯等人（2009） 鉴定了 RAD50 基因突变的复合杂合性。母体等位基因在 RAD50 基因外显子 21 的核苷酸 3277 处携带 C 到 T 的转变，导致密码子 1093（R1093X） 处的 arg 到终止子替换。父系等位基因携带点突变，导致蛋白质延伸 66 个氨基酸（604040.0002）。这种突变与无法检测到的 RNA 和蛋白质相关，并且在 350 个德国染色体中未发现。

.0002 奈梅亨断裂综合征样疾病
RAD50，TER1313TYR

Barbi 等人之前报道过一名患有奈梅亨断裂综合征样疾病（NBSLD; 613078） 的患者（1991），沃尔特斯等人（2009） 鉴定了 RAD50 基因突变的复合杂合性：无义突变（604040.0001） 和核苷酸 3939 处的 A 到 T 颠换，导致 1313 位的终止密码子被该位置的酪氨酸取代并延伸阅读框由 66 个氨基酸组成（X1313YextX*66）。异常父本等位基因产生的较大多肽的预测与分子量增加的蛋白质条带的检测一致。通过免疫印迹分析检测到的极少量的较大多肽被认为是蛋白质不稳定或不稳定的不间断mRNA的结果。在德国随机群体样本的 350 个染色体中未检测到这种突变。

.0003 奈梅亨断裂综合征样疾病
RAD50，c.2524G-A

Ragamin 等人发现，一名 15 岁女孩的父母为土耳其近亲，患有奈梅亨断裂综合征样疾病（NBSLD；613078）（2020） 在 RAD50 基因的外显子 15 中发现了纯合的 c.2524G-A 转变。预计该突变会导致剪接缺陷。通过全外显子组测序鉴定出该突变，父母双方均被证明是携带者。在 gnomAD 数据库（2019 年 7 月 10 日）中，该突变的次要等位基因频率为 0.0001072，尚未报告纯合子。对患者成纤维细胞的测试表明，突变导致 2 个 RAD50 mRNA 转录本，一个主要转录本完全跳过外显子 15，预计会导致移码和提前终止（Met800PhefsTer7），以及一个具有 val842-to- 的次要转录本。 ala（V842A） 替代。在受辐射的患者成纤维细胞中，RAD50 蛋白几乎检测不到，并且其他 2 个 MRN 复合体成员 MRE11A（600814） 和 NBN（602667） 也有所减少。