有丝分裂阻滞缺陷 2 类似 1；MAD2L1
有丝分裂停滞缺陷 2，酿酒酵母，同源样 1
有丝分裂停滞缺陷 2，酿酒酵母，同源物
MAD2，酿酒酵母，同源物
HGNC 批准的基因符号：MAD2L1
细胞遗传学定位：4q27 基因组坐标（GRCh38）：4:120,055,623-120,066,848（来自 NCBI）
▼ 克隆与表达
Li和Benezra（1996）回顾了有丝分裂检查点控制机制，并指出这些机制检查细胞是否准备好进行分裂。通过这些机制，如果有丝分裂纺锤体装置未正确组装或动粒未正确附着在纺锤体上，细胞周期进程将在与后期相关的不可逆事件发生之前被阻断。有丝分裂停滞缺陷-2（MAD2）是执行有丝分裂检查点所需的 6 个酵母基因之一。MAD2的功能障碍可能导致细胞恶性肿瘤或退化（Li and Nicklas, 1995；李和贝内兹拉，1996）。
Li和Benezra（1996）在缺乏着丝粒成分CBF1的酵母中筛选噻菌灵敏感性高拷贝数抑制基因时，孤立出了MAD2的人类同源物（MAD2L1）。（噻菌灵是一种有丝分裂纺锤体组装抑制剂。）编码205个氨基酸的多肽。DNA序列测定显示，人类克隆的开放阅读码组与酵母MAD2基因有60%的同一性。他们利用抗体电穿孔实验证明人类MAD2基因是HeLa细胞有丝分裂检查点的必要组成部分。通过免疫荧光研究，他们证明人类 MAD2 蛋白在染色体凝聚后定位于着丝粒，但在中期不再在着丝粒处观察到。基于这一观察，他们提出 MAD2 监控纺锤体动粒附件的完整性。Li和Benezra（1996）证明，人乳腺肿瘤细胞系T47D在诺考达唑治疗后，MAD2表达降低，并且未能阻止有丝分裂。他们提出，MAD2 功能的丧失也可能导致哺乳动物细胞中异常的染色体分离。
Chen等人（1996）分离出酵母MAD2的非洲爪蟾同源物。他们报告说，该基因的产物在纺锤体检查点组装中发挥着重要作用。与前期未附着的着丝粒相关的蛋白质和诺考达唑处理的细胞在中期从着丝粒中消失。
▼ 基因功能
Nelson等人（1999）利用酵母2-杂交分析，以几种解聚素和金属蛋白酶结构域（ADAM）蛋白的胞质尾部为诱饵，发现MAD2L1与TACE（ADAM17；ADAM17；603639），但不与 ADAM9（602713） 相互作用，ADAM9 与 MAD2L2 或与其他测试的 ADAM 相互作用。进一步的结合分析确定了包含富含脯氨酸的 SH3 配体结构域（PXPXXP）的 TACE 的 35 个氨基酸片段作为 MAD2L1 的相互作用位点。
Luo等（2002）表明，哺乳动物细胞中RNA干扰介导的MAD1（602686）功能抑制导致MAD2着丝粒定位丧失和纺锤体检查点受损。MAD1和CDC20（603618）含有具有共同共识的MAD2结合基序，作者鉴定了一类具有相似共识的MAD2结合肽（MBPs）。这些配体之一 MBP1 的结合引发了 MAD2 三级结构的广泛重排。MAD2 在与 MAD1 或 CDC20 结合基序肽结合后也经历了类似的显着结构变化。这些数据表明，在检查点激活后，MAD1 将 MAD2 招募到未附着的动粒，并可能促进 MAD2 与 CDC20 的结合。
Habu等人（2002）利用转染的HeLa细胞发现，在有丝分裂早期，大部分MAD2与p55CDC（CDC20）形成复合物。然而，随着细胞周期进行到有丝分裂中期，MAD2-p55CDC复合物解体，大部分MAD2结合CMT2（MAD2L1BP; 618136）主轴成型完成后。诺考达唑抑制的 HeLa 细胞中 CMT2 的过度表达表明，MAD2-CMT2 复合物的形成导致纺锤体检查点维持的抑制被取消。Hell细胞中CMT2的失活导致从中期到后期的转变延迟，随后导致细胞死亡。
Hernando et al.（2004）表明MAD2是E2F（参见189971）的直接靶点，因此在Rb（614041）通路缺陷的细胞中异常表达。同样，Mad2 在多种肿瘤类型中过度表达，与高 E2F 活性和不良患者预后相关。正常细胞和转化细胞中 Rb 途径损伤的产生产生了异常的 Mad2 表达和有丝分裂缺陷，导致非整倍性，因此 Mad2 升高直接导致这些缺陷。Hernando et al.（2004）得出的结论是，他们的结果证明了染色体不稳定性是如何作为细胞周期控制缺陷的副产品而出现的，从而损害了有丝分裂的准确性，并提出了一种新模型来解释人类癌症中非整倍性的频繁出现。
Guardavaccaro等人（2008）通过无偏筛选证明REST（600571）是F框蛋白β-TRCP（603482）的相互作用子。REST 在细胞周期的 G2 期被泛素连接酶 β-TRCP 降解，从而实现 Mad2（纺锤体组装检查点的重要组成部分）的转录去抑制。无法结合 β-TRCP 的稳定 REST 突变体在培养细胞中的表达抑制 Mad2 表达，并导致与 Mad2 杂合细胞中观察到的表型类似。特别是，Guardavaccaro 等人（2008）观察到与纺锤体检查点的错误激活一致的缺陷，例如有丝分裂缩短、姐妹染色单体过早分离、细胞桥和后期的错误分离、四倍体以及更快的有丝分裂滑移。纺锤体抑制剂的存在。通过表达致癌 REST-FS 突变体观察到无法区分的表型，该突变体不结合 β-TRCP。因此，G2 期间 REST 的 β-TRCP 依赖性降解允许纺锤体检查点的最佳激活，因此它是有丝分裂保真度所必需的。
Sotillo et al.（2010）表明，当抑制 Kras 时，通过有丝分裂检查点基因 Mad2 的过表达诱导小鼠染色体不稳定并不影响 Kras（190070）驱动的肺肿瘤的消退。然而，经历短暂的 Mad2 过度表达和随之而来的染色体不稳定的肿瘤的复发率显着升高。复发性肿瘤是高度非整倍体的并且具有不同的增殖途径激活。因此，Sotillo et al.（2010）得出结论，早期染色体不稳定可能是看似有效的抗癌治疗后肿瘤复发的原因。
PCID2（613713）在未成熟和早期B淋巴细胞中表达。Nakaya et al.（2010）发现，小干扰RNA（siRNA）敲低HeLa细胞中的PCID2会导致细胞周期异常，导致凋亡和超倍体细胞增加。PCID2的敲除也抑制了MAD2的表达，但不抑制其他细胞周期检查点蛋白的表达，例如MAD1（MAD1L1；602686）和BUBR1（BUB1B；602860），或细胞周期相关蛋白，如细胞周期蛋白A（CCNA2；123835）、细胞周期蛋白B1（CCNB1；123836）和CDK1（116940）。原位杂交显示，PCID2 siRNA处理后，与细胞核相比，细胞质中MAD2的表达明显降低，表明PCID2调节MAD2 mRNA代谢。Nakaya等人（2010）得出结论，PCID2对MAD2的调节可能是B细胞有丝分裂检查点的关键事件。
Hagan et al.（2011）利用转染的HeLa细胞表明p31（COMET）（MAD2L1BP）对未附着着丝粒的定位依赖于MAD2。p31（COMET）的过表达或MAD2的缺失会导致细胞后期过早，而p31（COMET）的缺失或MAD2的过表达会阻止细胞有丝分裂。耗尽p31（COMET）不会干扰染色体-微管附着，也不会阻止有丝分裂过程中检查点蛋白从动粒的正常解离。进一步分析表明，p31（COMET）耗尽后细胞停滞需要MAD2。此外，p31（COMET）作用于MAD2定时器功能的下游，但在着丝粒功能的上游，它通过与着丝粒的MAD1-MAD2支架快速结合和解离来在着丝粒上和离开。
▼ 生化特征
晶体结构
Yang等人（2007）以2.3埃的分辨率测定了人类MAD2-p31（COMET）复合物的晶体结构。p31（COMET）的结构包含3个中心α螺旋，一侧夹有7股β折叠，另一侧夹有短螺旋。p31（COMET）的整体折叠拓扑与配体结合的MAD2相似，并且p31（COMET）结合在MAD2的二聚化界面上。MAD2的C端片段发生重排，为p31（COMET）与不同MAD2构象异构体的特异性结合提供了结构基础。诱变研究验证了晶体结构的发现，并表明破坏 MAD2 结合的 p31（COMET）突变也破坏了 p31（COMET）克服纺锤体检查点依赖性有丝分裂停滞的能力。作者指出，在有丝分裂中，有一个MAD1（MAD1L1; 602686）-MAD2核心复合物通过MAD2二聚化将胞质MAD2募集至动粒，并将MAD2转化为适合p55CDC结合的构象异构体。Yang等（2007）通过将MAD2分子叠加在MAD1-MAD2和MAD2-p31（COMET）结构中，构建了MAD1-MAD2-p31（COMET）三元复合物的结构模型。他们发现MAD2-p31（COMET）复合物中的MAD2-p31（COMET）结合模式与MAD1-MAD2-p31（COMET）三元复合物的形成相容，因此，p31（COMET）阻断了MAD1-通过充当 MAD2 的结构模拟物来协助细胞质 MAD2 的募集。
冷冻电子显微镜
TRIP13（604507）与纺锤体组装检查点（SAC）拮抗剂p31（comet）（MAD2L1BP）结合，将活跃的封闭式MAD2（C-MAD2）重塑为不活跃的开放式MAD2（O-MAD2）。Alfieri等人（2018）确定了TRIP13-p31（comet）-C-MAD2-CDC20复合物的冷冻电镜结构，揭示了p31（comet）将C-MAD2招募到TRIP13六聚环上的指定位点，定位C-MAD2 的 N 末端插入 TRIP13 的轴向孔并使 TRIP13 环扭曲以启动重塑。分子模型表明，通过将 C-MAD2 夹在其轴向孔内，TRIP13 耦合了 ATP 驱动的六聚环沿 MAD2 的顺序易位，向上推动并同时旋转 p31（彗星）-C-MAD2 复合物的球状结构域。这会解开 C-MAD2 的 α-A 螺旋区域，该区域是稳定 C-MAD2 β-折叠所必需的，从而使 C-MAD2 不稳定，有利于 O-MAD2，并使 MAD2 与 p31（彗星）解离。Alfieri 等人（2018）得出的结论是，他们的研究提供了关于如何通过转换因子蛋白将特定底物招募到 AAA+ ATP 酶的见解，并提出了如何通过 AAA+ ATP 酶的轴向孔易位与蛋白质重塑耦合的模型。
▼ 测绘
Xu等（1997）通过荧光原位杂交（FISH）将MAD2L1基因定位到5q23-q31。然而，Krishnan 等人（1998）结合体细胞杂交分析、辐射杂交作图和 FISH 将基因定位到 4q27。Cahill等人（1999）通过辐射杂交组的分析证实MAD2L1基因定位于4q27。他们将一个相关基因 MAD2L2（604094）对应到 1p36，并将一个 MAD2 假基因对应到 14q21-q23。
▼ 动物模型
后期染色体分离的开始通过纺锤体组装检查点与中期染色体微管附着的完成相关联。为了确定Mad2蛋白在正常细胞分裂过程中的功能，Dobles等人（2000）敲除小鼠体内的Mad2基因。他们发现，在胚胎第 5.5 天缺乏 Mad2 的胚胎细胞（如 mad2 酵母）可以正常生长，但无法响应纺锤体破坏而停滞。在胚胎第 6.5 天，外胚层细胞开始快速细胞分裂，检查点的缺失导致广泛的染色体错误分离和细胞凋亡。相比之下，有丝分裂后滋养层巨细胞在没有 Mad2 的情况下也能存活。因此，即使在没有纺锤体损伤的情况下，纺锤体组装检查点对于有丝分裂细胞中准确的染色体分离和胚胎活力来说是必需的。
Shonn et al.（2000）通过比较野生型和mad2缺陷型酵母，描述了酿酒酵母减数分裂中纺锤体检查点的特征。在没有检查点的情况下，减数分裂 I 错误分离的频率随着染色体长度的增加而增加，最长染色体达到 19%。纺锤体检查点突变体中减数分裂 I 的不分离可以通过延迟后期的发生来预防。在重组缺陷突变体中，检查点延迟了后期 I 的生化事件，表明附着在微管上但未处于张力下的细胞可以激活纺锤体检查点。纺锤体检查点突变体在减数分裂 I 中比在减数分裂 II 中更能降低染色体分离的准确性，表明检查点缺陷可能导致唐氏综合症（190685）。Shonn et al.（2000）表明，出芽酵母纺锤体检查点在野生型有丝分裂中基本上是可有可无的，但在减数分裂染色体分离中起着关键作用。他们认为这种差异可能反映了有丝分裂和减数分裂 I 中不同的染色体联系。在有丝分裂中，姐妹染色单体的内聚力迫使姐妹动粒面向相反的纺锤体极。在减数分裂 I 中，同源物在远离着丝粒的重组位点连接，形成松软的连接。如果最近的重组事件距离长染色体的着丝粒较远，这个想法可以解释为什么长染色体在检查点缺陷的细胞中优先不分离。
Michel 等人（2001）报道，删除一个 MAD2 等位基因会导致人类癌细胞和小鼠原代胚胎成纤维细胞有丝分裂检查点缺陷。检查点缺陷细胞在纺锤体抑制剂存在的情况下表现出过早的姐妹染色单体分离，并且在不存在这些药物的情况下染色体错误分离事件的发生率升高。此外，Mad2 +/- 小鼠在长时间潜伏期后以很高的比例发生肺肿瘤，这表明肿瘤发生过程中有丝分裂检查点存在缺陷。
通过繁殖同时缺乏Mad2和p53（TP53;）的胚胎成纤维细胞 191170），Burds et al.（2005）表明，缺乏纺锤体检查点与p53失活结合时是非致命的。Mad2 和 p53 缺陷的囊胚在培养中也能存活。然而，纺锤体检查点和 p53 功能的同时丧失导致染色体不稳定。
